Изучение свойств фермента амилазы слюны

Реактивы и оборудование: раствор I₂ в KI, 1%-ный раствор крахмала, раствор Фелинга, 1% раствор хлорида натрия, 1% раствор медного купороса, 0,1 М растворы гидрофосфата и дигидрофосфата калия, 1% раствор сахарозы, 10% раствор гидроксида натрия, пробирки, пипетки, бюретки, индикаторная бумага, рН-метр, стеклянные трубочки, мерные цилиндры, пластинки с ячейками, стаканчики на 50 - 100 мл, воронки, водяные бани, стаканы, марля, лед, электроплитки, термометры, спиртовки, штативы.

Ферменты амилазы катализируют реакции гидролиза крахмала, относятся к классу гидролаз. Различают несколько типов амилаз: α-, β- амилазы, глюкоамилазы, амило-1,6 – глюкозидазы. Они катализируют гидролиз α-1,4 и α-1,6 связей в полисахаридах и олигосахаридах с образованием в качестве конечных продуктов мальтозы и глюкозы.

В процессе постепенного гидролиза крахмала под действием амилаз происходит образование промежуточных продуктов – декстринов разной степени сложности. За ходом гидролиза можно наблюдать по изменению окраски с йодом. Крахмал дает синее окрашивание, растворимый крахмал – сине-фиолетовое, амилодекстрины (молекулярная масса ≈10000) – фиолетовое, эритродекстрины (молекулярная масса 4000-6000) – от красно- бурого до красного, мальтодекстрины (молекулярная масса около 1000) не дают окрашивания с йодом точно так же, как глюкоза и мальтоза.

             + nН₂О                        +nН₂О                            +nН₂О

(С₆Н_1ОО₅)n ──→ амилодекстрины ──→ эритродекстрины──→  

синяя              сине-фиолетовая               красно-бурая

 окраска                     окраскаокраска

──→ мальтодекстрины ──→ мальтоза ──→ глюкоза

              не окрашены                     не окрашены

Приготовление разбавленной слюны

Ополаскивают рот водой 2-3 раза, и в чистый стаканчик собирают слюны столько, чтобы при ее разведении дистиллированной водой в 3 раза получилось 30 мл раствора. Полученный препарат амилазы фильтруют через марлю и используют для опытов.

Опыт 1.Обнаружение амилазы в слюне

Перед тем как изучать свойства фермента амилазы, необходимо убедиться в наличии в слюне этого фермента. С этой целью в одну пробирку наливают 5 мл раствора крахмала и 1 мл препарата амилазы. В контрольную пробирку помещают 5 мл раствора крахмала и 1 мл дистиллированной воды.

 Обе пробирки помещают в водяную баню при 40ºС и сразу начинают проводить качественные пробы с раствором йода. Для этого на пластинку в ячейки помещают капельки раствора йода и с помощью стеклянной трубочки или пипетки вносят в них из опытных пробирок по капельке раствора. Взятие проб повторяют через 30 секунд. Наблюдают за изменением окраски. Окраска растворов в пробах из опытной пробирки постепенно должна меняться:: сначала синяя, потом фиолетовая, далее красно-бурая, потом желтая.

Скорость реакции гидролиза крахмала зависит от концентрации крахмала и фермента. В случае если гидролиз идет медленно (все время образуется синяя окраска), или, наоборот, очень быстро (окраска сразу становится желтой), необходимо опыт поставить еще раз, изменив объемное соотношение взятых для опыта препарата амилазы и раствора крахмала. В этом опыте важно установить, каким должно быть это соотношение, чтобы в течение не более 5 минут можно было наблюдать окраску всех промежуточных продуктов реакции. Наблюдать за опытом удобно, когда он идет не слишком быстро и не слишком медленно.

В контрольной пробирке, где нет амилазы, окраска раствора все время должна оставаться синей.

Опыт 2. Влияние температуры на активность амилазы слюны.

При низкой температуре ферментативные реакции идут медленно. По мере повышения температуры скорость ферментативных реакций возрастает, причем с каждым повышением на 10 градусов скорость реакции возрастает в 2 – 3 раза ( у небиологических катализаторов в 2 – 4 раза). При достижении некоторого оптимума дальнейшее повышение температуры ведет к падению активности фермента и вследствие этого к снижению скорости ферментативных реакций. Объясняется это денатурацией ферментов, имеющих белковую природу. У большинства ферментов температурный оптимум лежит в пределах 40 - 60ºС.

 Сухие препараты некоторых ферментов способны выдерживать значительно более высокое нагревание без заметной потери своей активности. В растворе же эти ферменты при кипячении целиком теряют свою каталитическую активность. Низкая температура не инактивирует ферменты. В этих условиях они лишь замедляют или останавливают свое действие.

В 4 пробирки наливают по 2 мл раствора препарата фермента. Одну пробирку помещают в стакан со льдом, другую – в кипящую водяную баню, третью оставляют при комнатной температуре в штативе, а четвертую помещают в водяную баню при 40ºС. Пробирки при указанных температурах необходимо выдержать не менее 5 минут. После этого во все пробирки (не меняя температурных условий!), очень быстро добавляют по 6 мл раствора крахмала и хорошо перемешивают. Соотношение объема раствора крахмала и препарата фермента может быть тем, которое установлено в опыте 1.

 Сразу же начинают проделывать йодную пробу с раствором из каждой пробирки через каждые 0,5 – 1 минуту и записывают наблюдения. По изменению окраски крахмала с йодом судят о степени гидролиза крахмала в каждой пробирке. Результаты наблюдений анализируют и делают выводы.

Оформление результатов опыта

Результаты проведения опыта рекомендуется представить в форме таблицы:

                                                                                                     Таблица 1

Опыт 3. Влияние рН на активность амилазы слюны

Известно, что ферменты проявляют свою максимальную активность при определенных значениях рН (оптимум рН), и очень чувствительны к изменению кислотности среды, в которой они действуют. Изменение кислотности среды в ту или иную сторону от оптимума рН вызывает понижение активности фермента, что объясняется действием ионов водорода на ионизацию белковой молекулы, а, следовательно, на пространственную структуру фермента.

Готовят серию буферных растворов с рН 4,49; 5,59; 6,98; 7,38; 8,04, используя растворы гидрофосфата и дигидрофосфата калия и бюретки.

Приготовление фосфатных буферных смесей

                                                                                                    Таблица 2

Определение рН буферных смесей проводят с помощью рН-метра. Для приблизительной оценки рН растворов можно воспользоваться индикаторной бумагой или прибором Алямовского. Необходимо сразу приготовить большое количество буферных растворов с таким расчетом, чтобы каждому выполняющему опыт досталось по 5 мл каждой буферной смеси.

В пять пробирок наливают по 5 мл каждой из приготовленных буферных смесей, добавляют по 2 мл препарата фермента амилазы и по 5 мл раствора крахмала, тщательно перемешивают.

После этого все пробирки помещают в водяную баню при 40ºС. Наблюдения за ходом гидролиза начинают сразу, проводя йодную пробу на пластинках с растворами из пробирок. Отмечают, в какой пробирке гидролиз крахмала идет быстрее всего. На основании полученных результатов делают вывод об оптимальных условиях гидролиза крахмала по величине рН.

Оформление результатов опыта

Результаты проведения опыта рекомендуется представить в форме таблицы:

                                                                                                      Таблица 3