Осаждение белков фенолом и формалином.

Опыт 10. Фенол и формалин вызывают необратимую денатурацию белков. В две пробирки наливают по 1 мл раствора белка. В первую добавляют 1 мл насыщенного раствора фенола, а во вторую добавляют 1 мл раствора формалина. В пробирке, куда добавлен фенол, осадок образуется быстрее.

Осаждение белков спиртом

Опыт 11. Спирт вызывает дегидратацию молекул белка, вследствие чего происходит снижение устойчивости белковых молекул и денатурация белка. В пробирку наливают 2 мл раствора белка и осторожно по стенке пробирки наливают этиловый спирт так, чтобы он наслоился на белковый раствор. На границе двух жидкостей можно наблюдать белое кольцо денатурированного белка. 

Оформление работы

Опыты с 1 по 6 приводят полностью с объяснениями, а результаты опытов с 7 по 11 можно оформить в виде таблицы, в которой в первой колонке указывают белок, который используется в опыте, во второй колонке указывается вещество, которое используется для осаждения, в третьей колонке описываются наблюдаемые изменения, в четвертой – дополнительные замечания.

Лабораторная работа № 3

 Определение изоэлектрической точки казеина и желатина

Реактивы и оборудование: 0,1 М, 0,2 М и 1 М растворы уксусной кислоты, 0,4 % раствор казеина в 0,2 М растворе ацетата натрия, 0,1 М раствор ацетата натрия, 1% раствор желатина, 96% этанол или ацетон, штативы, пробирки, фотоэлектроколориметр, кюветы, пипетки на 5 и 10 мл.

Изоэлектрической точкой белка называется величина pH среды, при которой суммарный электрический заряд белка равен нулю. Растворы белков в изоэлектрической точке наименее устойчивы, нейтральные молекулы белка легко выпадают в осадок. Вследствие этого определение изоэлектрической точки может быть сведено к определению pH раствора, при котором наблюдается наиболее полное и быстрое выпадение белка в осадок. Для получения растворов с различной величиной водородного показателя пользуются буферными растворами.   

Опыт 1. Для определения изоэлектрической точки казеина в 7 сухих пробирок наливают последовательно реактивы в количествах (в мл), указанных в таблице 1.

                                                                                             Таблица 1

Растворы тщательно перемешивают. Казеин – гидрофобный белок, не имеет водной оболочки, менее устойчив и поэтому через 5-10 минут наблюдается помутнение растворов. Наибольшее помутнение наблюдается в той пробирке, где рН соответствует изоэлектрической точке казеина. 

Если визуально определить пробирку с максимальным помутнением не удается, следует использовать фотоэлектроколориметр. С помощью фотоэлектроколориметра нужно провести определение процента пропускания света (Т%) приготовленными растворами, мутность которых объясняется образованием осадков белков в виде стабильной суспензии.

Для этого за 15-20 мин до работы включают прибор, в дальнее кюветное отделение ставят кювету с дистиллированной водой, а в ближнее отделение ставят кювету с анализируемым раствором. Сначала свет пропускают через воду, стрелку прибора с помощью грубой и тонкой регулировки ставят на 100% пропускания света. Потом против пучка света ставят кювету с анализируемым раствором, определяют и записывают показания стрелки прибора (процент пропускания света).

Аналогичным образом определяют % пропускания света во всех пробирках. Пробирка, в которой пропускание света будет минимальным, соответствует изоэлектрической точке белка.

Опыт 2. Для определения изоэлектрической точки желатина в 6 сухих пробирок последовательно наливают реактивы в количествах (в мл), указанных в таблице 2.

Содержимое каждой пробирки перемешивают и затем во все пробирки медленно по стенке добавляют по 2 мл 96% этанола (или ацетона). Желатин – белок гидрофильный, обладающий двумя факторами устойчивости: зарядом и водной оболочкой. Спирт понижает устойчивость белка.

                                                                                                                  Таблица 2

Через 30 минут определяют изоэлектрическую точку желатина. Она будет соответствовать рН пробирки с максимальной степенью помутнения. В случае, если визуально определить пробирку с максимальной степенью помутнения не удается, можно использовать фотоэлектроколориметр для определения процента пропускания света.

Оформление работы

Результаты опытов представляют на графиках, на которых по оси абсцисс откладывают значения рН, а по оси ординат откладывают обратные проценту пропускания света значения (1/Т). Максимум на графиках будет соответствовать изоэлектрической точке казеина и, соответственно, изоэлектрической точке желатина.     

Примечание: Работу делали только с желатином

Лабораторная работа № 4

Разделение аминокислот методом