Распределительной хроматографии на бумаге

Реактивы и оборудование:Бутанол, ледяная уксусная кислота, стандартная смесь растворов аминокислот-свидетелей лизина, глицина, фенилаланина, 0,1 М растворы фенилаланина, глицина, лизина, 1% раствор нингидрина в ацетоне или в 96% этиловом спирте, хроматографические камеры, хроматографическая бумага, фильтровальная бумага, микропипетки, делительные воронки, колбы или стаканы на 50 мл, цилиндры мерные, линейки, ножницы, простые карандаши, иголки швейные, нитки, пластилин, стеклянные пластинки, сушильный шкаф или электрические плитки, пульверизатор или чашки Петри для проявления хроматограмм, таблицы со значениями Rf.

Изучение аминокислотного состава различных биологических тканей представляет собой важную задачу. В настоящее время для анализа аминокислот с успехом применяются различные виды хроматографии, в том числе и распределительной.

Метод распределительной хроматографии на бумаге используется для разделения смесей разнообразных органических веществ, и основан он на различной растворимости веществ в разных несмешивающихся растворителях.

Если какое-нибудь растворенное вещество распределено между равными объемами двух несмешивающихся жидкостей, то отношение его концентраций в этих двух фазах в состоянии равновесия при данной температуре называют коэффициентом распределения.

Разделение веществ происходит вследствие различия в распределении их между двумя жидкими фазами, одна из которых подвижна, а другая – нет. Хроматографическая бумага обладает свойством поглощать воду из воздуха и задерживать ее между своими целлюлозными волокнами. Эту воду можно рассматривать как один из растворителей: она представляет собой неподвижную фазу. Когда по бумаге под действием капиллярных сил движется неводный растворитель (подвижная фаза), молекулы вещества, нанесенного на бумагу, распределяются между двумя фазами в соответствие с их коэффициентом распределения. Чем выше растворимость вещества в подвижной фазе, тем дальше оно продвинется по бумаге с растворителем и наоборот.

Расстояние, пройденное нанесенным на бумагу соединением в направлении движения растворителя, характеризуется величиной Rf (коэффициент подвижности) и определяется следующим отношением:

В стандартных экспериментальных условиях эта величина является для данного соединения постоянной и соответствует его коэффициенту распределения. Чем больше различие в величинах Rf разделяемых веществ, тем лучше их разделение.

Хроматографирование на бумаге можно проводить восходящим и нисходящим способом. В первом случае разделение веществ происходит по мере движения растворителя под действием капиллярных сил вверх, во втором – под действием капиллярных сил и силы тяжести. Первый вид хроматографии из-за простоты используется чаще, однако скорость движения при нисходящей хроматографии значительно выше.

Для определения расположения аминокислот после хроматографии бумагу высушивают, просматривают в ультрафиолетовом свете или опрыскивают раствором нингидрина и нагревают.

Все операции с бумагой проделывают тщательно вымытыми руками или в перчатках. В противном случае после проявления на бумаге выступает много пятен, не относящихся к аминокислотам, выделенным из биологического материала.