Опыт 3. Обнаружение тирозиназы в картофеле

Тирозиназа катализирует окисление фенолов и родственных по строению соединений. Она является металлопротеином, содержащим медь, которая служит переносчиком электронов от субстрата на кислород воздуха. Тирозиназа содержится в растениях, грибах, в отдельных органах и тканях животных.

Несколько кусочков свежего картофеля растирают в ступке с чистым песком, добавляют в ступку 10 – 15 мл дистиллированной воды и фильтруют через двойной слой марли. Экстракт делят на две равные части. Одну часть в пробирке или колбочке кипятят для денатурации фермента.

В две пробирки наливают по 1 мл раствора аминокислоты тирозина. В одну пробирку добавляют первую часть некипяченого экстракта картофеля. Во вторую пробирку наливают охлажденный кипяченый экстракт. Обе пробирки ставят в водяную баню (40°С). Время от времени пробирки встряхивают. Через некоторое время наблюдают, что в первой пробирке раствор постепенно становится розово-красным, потом бурым и, в конце концов, черным. В пробирке с кипяченым экстрактом фермент не активен из-за денатурации и поэтому окисление тирозина происходит значительно медленнее.

Опыт 4. Обнаружение уреазы в соевой муке.

Уреазагидролитически расщепляет мочевину на аммиак и углекислый газ. Реакция высокоспецифична. Фермент в значительных количествах содержится в сое.

В пробирку наливают 3 мл 5% раствора мочевины, добавляют 20 – 30 мг соевой муки и 2 капли фенолфталеина. Пробирку оставляют при комнатной температуре и наблюдают за появлением розовой окраски, что происходит вследствие смещения рН раствора в щелочную сторону за счет образования аммиака.

За образованием аммиака также можно наблюдать по изменению окраски влажной красной лакмусовой бумажки, помещенной в отверстие пробирки. Через некоторое время бумажка синеет от выделяющегося аммиака, который можно обнаружить и по запаху.

Опыт 5. Обнаружение сахаразы в дрожжах.

Фермент сахараза катализирует реакцию гидролиза сахарозы до глюкозы и фруктозы. Большое количество этого фермента содержится в дрожжах.

2 – 3 г дрожжей растирают в ступке с чистым песком, добавляют 15 мл дистиллированной воды, настаивают при перемешивании 10 мин, сначала фильтруют через марлю, а потом центрифугируют 5 мин (3 тыс. об/мин). Полученныйцентрифугат используют для проведения опыта.

В две пробирки наливают по 3 мл раствора сахаразы – экстракта из дрожжей. Одну пробирку, контрольную, кипятят для разрушения фермента и охлаждают. В обе пробирки наливают по 3 мл раствора сахарозы и ставят в водяную баню (40°С) на 10 – 15 минут.

 По истечении времени в пробирки добавляют по 2 мл раствора Фелинга, нагревают. В пробирке с активным ферментом образуется красный осадок закиси меди, поскольку в ходе гидролиза образовалась глюкоза, которая восстановила медь из Cu+² до Cu+^1. В контрольной пробирке образование оксида не наблюдается.                       

Оформление работы

По каждому опыту описывается порядок его выполнения, условия проведения опыта, приводятся уравнения реакции и записываются наблюдения.

Лабораторная работа № 11