Подготовка растворителя и хроматографической камеры

Для хроматографии используется специальная или приспособленная стеклянная камера с плоским ровным дном. На дно камеры наливается бутаноловый растворитель в таком количестве, чтобы на дне камеры образовался слой высотой 7 – 10 мл. Он готовится смешиванием бутанола, ледяной уксусной кислоты и воды в соотношении 4:1:5. Жидкости помещают в делительную воронку, осторожно встряхивают и дают отстояться образовавшейся эмульсии. Нижний слой сливают через кран делительной воронки, а верхний слой используют для дальнейшей работы.

Разметка бумаги и нанесение на нее растворов

Берут лист хроматографической бумаги, соответствующий размерам хроматографической камеры. По высоте он должен быть на 1 см ниже верхнего края камеры, а по ширине – не касаться стенок камеры. На расстоянии 2 см от одного из узких концов листа бумаги простым карандашом проводят линию старта и на ней карандашом отмечают места нанесения аминокислот - свидетелей и идентифицируемых аминокислот. На другом конце бумаге в центре иголкой прокалывают отверстие и пропускают через него нитку, с помощью которой лист бумаги будет закрепляться в хроматографической камере. На этом же конце бумаги карандашом пишется фамилия студента.

 В качестве аминокислот – свидетелей берут смесь растворов аминокислот, например, лизина, глицина и фенилаланина. Для идентификации берут растворы тех же аминокислот, но приготовленных по отдельности и не подписанных (готовятся перед опытом лаборантом или преподавателем). Микропипеткой в одно отмеченное место наносят каплю смеси растворов аминокислот – свидетелей, а в другое – каплю идентифицируемой аминокислоты. Диаметр пятна не должен превышать 1 см. Бумагу держат на воздухе до полного высыхания пятен. В место, куда наносят идентифицируемую аминокислоту, можно нанести каплю раствора другой аминокислоты, но только после полного подсыхания первой.

Хроматографическую камеру ставят в отведенное место. Листок бумаги с нанесенными аминокислотами осторожно опускают в камеру с растворителем почти до дна и закрепляют листок в подвешенном состоянии с помощью нитки, концы которой можно закрепить кусочками пластилина. Растворителя в камере должно быть столько, чтобы он не касался нижнего края пятен нанесенных растворов. Необходимо проследить, чтобы бумага нигде не касалась стенок камеры. Камеру сверху накрывают стеклом. Хроматографирование проводят в течение нескольких часов до достижения фронтом растворителя верхнего края бумаги. После этого бумагу вынимают, карандашом отмечают фронт растворителя и оставляют сушить на воздухе.

Проявление хроматограммы и идентификация аминокислот

Высушенную хроматограмму проявляют под тягой раствором нингидрина, равномерно смачивая этим раствором ее поверхность. Для этого используют кисточку из ваты или пульверизатор. При проявлении нельзя класть хроматограмму на стол, она должна находиться «на весу». Нельзя браться за смоченную поверхность руками, остаются отпечатки пальцев. Пропитанную хроматограмму помещают в сушильный шкаф на 15 мин при 70° C или держат ее над горячей плиткой до полного проявления.

 Аминокислоты обнаруживаются в виде сине-фиолетовых пятен. Идентификацию аминокислот проводят по совпадению на хроматограмме положения анализируемых аминокислот и аминокислот-свидетелей.

Аминокислоты – свидетели будут располагаться в следующем порядке: нижнее пятно соответствует лизину, среднее – глицину, верхнее – фенилаланину. Аминокислоты, располагающиеся на одном уровне, являются идентичными. Определение аминокислот можно осуществить и по значению Rf. Для этого измеряют расстояние от линии старта до линии фронта растворителя (В) и расстояние от старта до центра пятна идентифицируемой аминокислоты (А). Отношение А/В дает значение Rf для данной аминокислоты в данном растворителе. В справочной литературе содержатся сведения по коэффициентам Rf для многих веществ, разделяемых в различных системах растворителей (Справочник биохимика, с. 912). 

Оформление работы

Записывают в тетради порядок выполнения работы с краткими пояснениями, рассчитывают значения Rf для каждой аминокислоты, указывают, какая аминокислота находилась в анализируемом растворе, хроматограмму приклеивают в тетрадь.

Лабораторная работа № 5

Определение концентрации белка в сыворотке крови рефрактометрическим методом

Реактивы и оборудование:Сыворотка крови, спирт для промывки призмы; рефрактометр, пипетка.

1. Юстировка Перед началом определения белка необходимо убедиться, что прибор настроен (отюстирован). Для этого нужно открыть рабочую камеру, на призму нанести несколько капель дистиллированной воды и осторожно закрыть. Глядя в окуляр, с помощью измерительного винта установить шкалу на деление 1,333 (показатель преломления воды). При этом в рабочем поле должны совместиться граница светотени и точка пересечения диагональных линий. Если этого нет, то не изменяя показания шкалы, добиваются совмещения регулировочным ключом.

2. Ход определения. Для определения содержания белка в сыворотке крови нужно открыть рабочую камеру, насухо вытереть призму и нанести на нее 1-2 капли раствора исследуемого белка. Осторожно закрыть, чтобы не было пузырьков воздуха в окне и с помощью измерительного винта добиться совмещения границы светотени и точки пересечения диагональных линий.

По шкале отметить значение коэффициента преломления, согласно которому по таблице 1 найти процентное содержание белка. Сравнить полученный результат с нормативными показателями (табл. 1 приложений) и сделать вывод.

Таблица 1

Расчет содержания белка по показателю преломления

Лабораторная работа № 6

Определение концентрации белка колориметрическим