Реакция на слабосвязанную серу (реакция Фоля)

Лабораторная работа № 1

Качественные реакции на белки и аминокислоты

Реактивы, оборудование: 10% и 20% растворы гидроксида натрия, 1% раствор медного купороса, 0,5% водный раствор нингидрина, 1% раствор нингидрина в 95% растворе ацетона, конц. азотная и серная кислоты, реактив Миллона, реактив Фоля, 0,1% раствор фенола, ледяная уксусная кислота, 5% свежеприготовленный раствор нитропруссида натрия, 0,2% спиртовой раствор α-нафтола, раствор гипобромита натрия, крист. мочевина, 40% раствор мочевины, 0,01% раствор аргинина, 0,01% раствор тирозина, 0,005% раствор триптофана, раствор глиоксиловой кислоты, 1% раствор яичного белка, 1% раствор желатина, 10% раствор углекислого натрия, 1% раствор сульфаниловой кислоты в 5% растворе соляной кислоты (1:3), 5% раствор нитрита натрия; штативы с пробирками, держатели, спиртовки, стеклянные трубочки, пипетки.

Биуретовая реакция

Биурет – вещество, образующееся при нагревании мочевины и содержащее пептидные связи в молекулах. Если к раствору этого вещества добавить гидроксид натрия и несколько капель раствора медного купороса, то образуется продукт розового или сине-фиолетового цвета. Полученное окрашенное вещество называется биуретовым медным комплексом, а сама реакция получила название биуретовой.

    О                       ООО

     ║                       ║                     ║        ║

Н₂N- С - NН₂ + Н₂N- С - NН₂ →Н₂N - С - N Н- С - NН₂ +N Н ₃

Мочевина                                                         биурет

Биуретовый медный комплекс

Биуретовую реакцию могут давать все вещества, которые содержат не менее двух пептидных связей. Раствор белка в щелочной среде при взаимодействии с ионами меди также приобретает сине-фиолетовый цвет, а продукты неполного гидролиза белков дают розовое окрашивание. И в этом случае происходит образование биуретового медного комплекса.

Интенсивность окраски биуретового комплекса зависит от концентрации белка и количества медной соли в растворе, поэтому биуретовую реакцию можно использовать для определения концентрации белка в растворе.

Опыт 1. К 1 мл 1% раствора яичного белка прибавляют 1 мл 10% раствора гидроксида натрия, 2-3 капли 1% раствора медного купороса и все перемешивают. Раствор приобретает фиолетовую окраску.

Опыт 2. Небольшое количество кристаллической мочевины поместить в пробирку, расплавить над спиртовкой и продолжать нагревать в течение 1-2 минут. Пробирку охладить, добавить 1-2 мл дист. воды для растворения образовавшегося вещества и проделать с ним биуретовую реакцию. Раствор должен приобрести розовую окраску.

Нингидриновая реакция

Эту реакцию дают все аминокислоты, пептиды, белки, имеющие в α – положении аминогруппы. В результате взаимодействия α - аминокислоты с нингидрином образуется Шиффово основание, которое перегруппировывается, декарбоксилируется и в присутствии воды расщепляется на альдегид и аминодикетогидринден.

Аминодикетогидринден конденсируется еще с одной молекулой нингидрина. Образующееся соединение после енолизации переходит в окрашенную форму, получившую название «сине-фиолетовый комплекс Руэмана». Если реакция протекает в среде с органическими растворителями (спиртом или ацетоном), то продукт этой реакции содержит в своем составе радикал исходной аминокислоты, который и обуславливает различную окраску этого продукта: голубую, красную, синюю, фиолетовую, а в присутствии пролина – желтую.

Эта реакция с раствором нингидрина в ацетоне или спирте используется для идентификации аминокислот после хроматографии, для открытия отдельных аминокислот и для определения их количества.

Опыт 3. К 2 мл раствора белка добавляют несколько капель 0,5% водного раствора нингидрина и кипятят 1-2 мин. В пробирке появляется розово-фиолетовое окрашивание, а с течением времени раствор синеет.

Опыт 4. Аналогичную реакцию проделывают с раствором глицина и пролина, используя раствор нингидрина в ацетоне.

Ксантопротеиновая реакция

Этой реакцией можно доказать присутствие в белке ароматических аминокислот: триптофана, тирозина, фенилаланина. При добавлении к раствору белка концентрированной азотной кислоты появляется желтое окрашивание. Если к полученному раствору добавить щелочь, то окраска переходит в оранжевую.

Ксантопротеиновая реакция не является строго специфичной. Так как она обусловлена нитрованием ароматического ядра, то ее дают многие ароматические соединения, не являющиеся аминокислотами, например, фенол.

В щелочной среде нитропроизводные аминокислот образуют соли хиноидной структуры, окрашенные в оранжевый цвет.

Опыт 5. В одну пробирку наливают 2 мл раствора яичного белка, а в другую – 2 мл раствора желатина. В обе пробирки добавляют по 1 мл конц. азотной кислоты и нагревают. В первой пробирке образуется желтый осадок, а во второй – очень слабое окрашивание, так как желатин почти не содержит ароматических аминокислот. После охлаждения в каждую пробирку добавляют 20% раствор гидроксида натрия или концентрированный раствор аммиака до появления оранжевого окрашивания вследствие образования натриевой соли нитротирозина.

Реакция Миллона

Аминокислота тирозин, а также белки, содержащие в своем составе эту аминокислоту, взаимодействуют с реактивом Миллона, (смесь нитратов и нитритов оксида ртути (I) и (II) в концентрированной азотной кислоте). При кипячении образуется кроваво-красный осадок ртутной соли динитротирозина. Белки, которые не содержат тирозина, такие как желатин, протамины, реакцию Миллона не дают.

Опыт 6. Реакцию Миллона проделывают с тремя веществами: яичным белком, желатином и фенолом. В первую пробирку добавляют 2 мл 1% раствора яичного белка, во вторую – 2 мл 0,1% раствора фенола, в третью – 2 мл 1% раствора желатина. В каждую пробирку добавляют по 1 мл раствора Миллона и осторожно нагревают. В пробирке с яичным белком появляется кроваво-красное окрашивание, в пробирке с фенолом – красное, а в пробирке с желатином жидкость бесцветна или слегка желтеет.

Реакция на слабосвязанную серу (реакция Фоля)

У белков, содержащих цистеин, при нагревании в щелочной среде происходит гидролиз сульфгидрильных групп с образованием сульфида натрия. Сульфид натрия с плюмбитом свинца дает черный или бурый нерастворимый осадок сульфида свинца. Реакция протекает по уравнению:

В аминокислоте метионин сера связана прочно, поэтому метионин в отличие от цистеина этой реакции не дает. 

Опыт 7. В пробирку налить 2 мл раствора белка и 2 мл реактива Фоля (к 5% водному раствору ацетата свинца добавляют 30% раствор гидроксида натрия до растворения образовавшегося осадка). Полученный раствор прокипятить, через 1 – 2 минуты появляется черный или бурый осадок сульфида свинца.