Работа  № 3. Определение  содержания  гемоглобина в  крови цианметгемоглобиновым методом по Драбкину.

      Принцип метода.  Гемоглобин окисляют в метгемоглобин (гемиглобин) железосинеродистым калием (красная кровяная соль), образующийся с ацетонциангидрином окрашенный цианметгемоглобин (гемиглобинцианид) определяют колометрически.

       Ход работы. В пробирку (опыт) (осторожно!) отмерить 5 мл. трансформирующего раствора (реактив Драпкина), к нему добавить 0,02 мл крови (разведена в 251 раз). В другую пробирку (стандарт) прилить 5 мл реактива Драпкина и 0,02 мл стандартного раствора. Содержимое обеих пробирок перемешать и в течение 30 минут выдержать при комнатной температуре. Измерить экстинцию опытной и стандартной проб на ФЭКэ при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см против холостой пробы (трансформирующий раствор).

     Расчет содержания гемоглобина произвести по формуле:

    Hb(г/л)=Е_оп/Е_ст ×С × К × 0,01, где

Е_оп – экстинкция опытной пробы;

Е_ст – экстинкция стандартного раствора;

С – концентрация гемиглобинцианида в стандартном   растворе (59,75 мг/100мл);

К – коэффициент разведения крови (251);

0,01 – коэффициент пересчета мг/100 мл в г/л.   

Сопоставить с нормой содержания у здоровых людей и сделать вывод.

У здоровых людей концентрация гемоглобинаколеблется в следующих пределах:

 -новорожденные – 210 – 225 г/л;

 - дети в возрасте 1 месяца – 145 - 165 г/л;

 - дети в возрасте 6 месяцев – 115 - 130 г/л;

 - дети в возрасте 1 года – 110 - 120 г/л;

 - дети в возрасте 14-15 лет – 130 -150г/л;

 - взрослые женщины – 120 - 140 г/л, мужчины – 135 - 160г/л.

    Клинико-диагностическое значение определения содержания гемоглобина в крови:снижение содержания гемоглобина в крови наблюдается при анемиях различного генеза, при острых и хронических кровотечениях, некоторых инфекционных заболеваниях; повышение – при сгущении крови, при заболеваниях, связанных с увеличением количества эритроцитов (эритремии) и др.

Эталоны ответов на тесты

Вид 1. 1. 1. – б; 1.2. - б, в, г.

Вид 2. 2.1. 1-б; 2-а; 3-б; 4-в; 5-а; 6-г;

                  2.2. 1-а, в; 2-а; 3-а, б; 4-в; 5-а, б; 6-а, б.

Вид 3. 3.1. а-5, б-2, в-2, г-3, д-3, е-4; 3.2. 3→4→1→2→5.

Вид 4. 4.1. А (+, +, +); Д (-, +, -).

Эталоны ответов на ситуационные задачи

Задача 1. Уровень мочевой кислоты выше нормы – гиперурикемия. Наиболее вероятная причина – подагра. Рекомендуется ограничить употребление мяса и рыбы – источника пуринов. При болях в суставах – обратиться к врачу.

Задача 2. а) Болезнь Гирке вызвана дефектом в структуре фермента глюкозо-6-фосфатазы в печени, который обеспечивает дефосфорилирование глюкозы и ее выход в кровь. Отсутствие активного фермента вызывает замедление гликогенолиза.

б) В результате в гепатоцитах увеличивается содержание глюкозо-6-фосфат.

в) Высокие концентрации глюкозо-6-фосфата активируют пентозофосфатный путь и наблюдается образование больших количеств рибозо-5-фосфата, который вовлекается в синтез ФРДФ и пуриновых нуклеотидов по основному и запасному путям.

Избыточный синтез пуринов ускоряет их катаболизм. Продукция мочевой кислоты оказывается увеличенной.

Ускоренным в этих условиях оказывается катаболизм глюкозо-6-фосфата до лактата. Лактат закисляет жидкие среды организма, а это снижает растворимость солей мочевой кислоты и ее выведение с мочой (при рН 5.0 мочевая кислота не диссоциирована и ее растворимость в моче намного меньше, чем при рН 7.0, при котором она представлена в основном растворимыми уратами).

Занятие № 5. Зачетное занятие по модулю «Обмен и функции аминокислот, белков и нуклеиновых кислот».

Цель занятия.Закрепить знания основных путей обмена аминокислот, тканевого синтеза и распада нуклеиновых кислот и белков, обмена нуклео- и хромопротеидов, выявить степень усвоения студентами изучаемого материала.

Содержание занятия.В начале занятия студенты проходят тестирование на компьютере. Каждому студенту будет предложено ответить на 12 тестовых заданий. Условием допуска до устного собеседования является выполнение не менее 70 % тестов (8 заданий). При собеседовании студент должен ответить (устно) на 3 контрольных вопроса из раздела: «Обмен простых белков и амино­кислот, матричный синтез нуклеиновых кислот и основы молеку­лярной генетики, обмен нуклео- и хромопротеидов». Помимо знаний теории при собеседовании будет обращаться внимание на знание принципа методов работ, выполненных на практических занятиях, умение интерпретировать полученные результаты анализов.

Методические указания к самоподготовке

При подготовке к коллоквиуму рекомендуется просмотреть указания к предыдущим занятиям по пройденным темам. Необходимо также повторить формулы аминокислот для облегчения запоминания химизма их метаболических превращений. Требуется просмотреть лабораторные работы, относящиеся к данной теме. Необходимо при этом обратить внимание на суть метода, клиническую значимость, нормы содержания.

Контрольные вопросы к коллоквиуму

1. Биологическая роль белков. Нормы белка в питании. Белковый минимум питания. Азотистый баланс.

2. Переваривание белков. Ферменты переваривания. Продукты переваривания, структура и дальнейшая судьба последних.

3. Представление о механизме активации протеолитических ферментов желу­дочно-кишечного тракта.

4. Назовите протеолитические ферменты поджелудочной железы и кишечного сока, напишите химизм ферментативного расщепления карбокси- и аминопептидазой выбранного вами пентапептида.

5. Особенности всасывания и транспорта аминокислот.

6. Понятие о гниении белков в кишечнике. Напишите химизм образования ядовитых продуктов и обезвреживания их в печени с помощью ФАФС и УДФГ.

7. Роль моноамино- и диаминооксидаз, а также процессов ацетилирования в механизме обезвреживания токсинов. Продукты обезвреживания, их структура.

8. Клеточный метаболический пул аминокислот. Пути образования и использования аминокислот в тканях. Интенсивность процессов обновления бел­ков в тканях.

9. Тканевой распад белков. Роль лизосомальных ферментов в этих процессах.

10. Переаминирование аминокислот. Ферменты переаминирования. Механизм реакции. Биологическое значение переаминирования и определения трансаминаз в сыворотке крови при инфаркте миокарда, ревматизме, болезнях печени.

11. Тканевые превращения аминокислот. Дезаминирование аминокислот (прямое и непрямое). Роль a-кетоглутаровой и глутаминовой кислот в дезаминировании и переаминировании аминокислот. Гликогенные и кетогенные амино­кислоты.

12. Декарбоксилирование аминокислот. Ферменты декарбоксилирования, ха­рактер простетической группы. Образование биогенных аминов. Влияние на метаболизм и физиологические функции. Роль аминооксидаз.

13. Особенности обмена фенилаланина и тирозина. Биологическая роль. Врожденные нарушения обмена, ферментные блоки. Фенилкетонурия, фенилпировиноградная олигофрения, альбинизм, алкаптонурия.

14. Особенности обмена серосодержащих аминокислот. S-аденозилметионин и его роль в процессах метилирования. Глутатион: структура, биологическая роль.

15. Особенности обмена глицина и аргинина. Их роль в образовании креатина и креатинфосфата.

16. Обмен дикарбоновых аминокислот. Участие в обезвреживании аммиака.

17. Пути обезвреживания аммиака в тканях: синтез глутамина, восстанови­тельное аминирование аминокислот. Глутаминаза почек. Образование и выведение солей аммония в почках, физиологическая роль этих процессов.

18. Биосинтез мочевины как основной путь обезвреживания аммиака. Объясните механизм включения двух атомов азота в молекулу мочевины. Энергети­ческая обеспеченность процесса. Количественное определение мочевины по Рaшковану.

19. Структура и биосинтез ДНК. Современные представления о репликации ДНК. Инициация репликации – образование репликативной вилки.

20. Особенности ДНК – полимераз и их участие в процессе репликации. Элонгация и терминация репликации ДНК. Понятие о теломерах и роль теломеразы.

21. Структура и биосинтез РНК. Характеристика РНК-полимераз и этапов транскрипции: инициации, элонгации, терминации, процессинга РНК.

22. Генетический код и его свойства. Концепция: один ген - один белок, цистрон - одна подипептидная цепь. Особенности строения информационной РНК.

23. Особенности строение транспортных РНК. Адапторная функция тРНК. Взаимодей­ствия аминокислота – тРНК, кодон-антикодон. Строение и роль рибосом в синтезе белка.

24. Биосинтез белка. Этапы матричного синтеза белка: рекогниция, инициация и инициирую­щий комплекс, элонгация и транслокация, терминация.

25. Посттрансля­ционные изменения белка, понятия о фолдинге, прионовых болезнях.

26. Регуляция действия генов и биосинтез белка. Схема Жакоба и Моно. Биохимические механизмы клеточной дифференцировки и онтогенеза.

27. Биохимические основы биологической эволюции, наследственности и измен­чивости. Особенности регуляции генов у эукариотов, характеристика процессов индукции и репрессии, энхансеры, сайленсеры.

28. Молекулярные механизмы мутации и их последствия. Мутагенные агенты. Система биохимического контроля структуры ДНК.

29. Обмен нуклеопротеидов. Переваривание и всасывание нуклеотидов. Ферменты переваривания. Конечные продукты переваривания.

30. Представьте схему путей синтеза пуриновых нуклеотидов. Разъясните участие витаминов, аминокислот и СО₂ в данном процессе.

31. Пути тканевого синтеза пиримидиновых нуклеотидов.

32. Распад ДНК и РНК в желудочно-кишечном тракте, ферменты распада. Тканевой распад ДНК и РНК, химизм и ферменты деградации.

33. Особенность и химизм тканевого распада пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов. Конечные продукты.

34. Нарушение обмена пуриновых оснований. Подагра, ее симптоматика.

35. Глицино-янтарный цикл Шемина. Понятие о порфириях. Синтез гемоглобина.

36. Распад гемоглобина. Гемоксигеназный комплекс. Химизм образования билирубина.

Примеры тестовых заданий

1. Функциями ДНК являются ….

а) хранение генетической информации

б) передача генетической информации по наследству дочерним клеткам.

в) матрица для синтеза белка

г) реализация генетической информации

д) конструирование рибосомы

2. Наименьшей молекулярной массой обладает ….

        а) ДНК

        б) 28S рРНК

        в) тРНК

        г) мРНК

3. Возможные причины подагры – это ….

       а) избыточное поступление нуклеопротеинов с пищей

       б) снижение скорости реутилизации пуриновых оснований

       в) снижение скорости образования мочевой кислоты

       г) ускорение синтеза нуклеиновых кислот

          д) нарушение синтеза ОМФ

4. Ферментами, расщепляющими нуклеотиды в желудочно-кишечном тракте, являются ….

         а) дипептидазы                       д) фосфатаза

        б) рибонуклеазы                      е) фосфолипаза

        в) трипсин                                ж) амилаза

        г) нуклеотидазы                       з) нуклеозидазы

5. Для синтеза пиримидинового кольца de novo используются ….

        а) СО₂

        б) энергия АТФ

        в) аммиак

        г) аланин

        д) аспаргиновая кислота

        е) глутаминовая кислота

6. Праймер ….

        а) состоит из рибонуклеотидов

        б) синтезируется под действием ДНК – полимеразы α (альфа)

          в) необходим для фунционирования ДНК – полимеразы δ (дельта)

        г) комплементарен фрагменту в цепи материнской ДНК

7. В инициации транскрипции участвуют ….

         а) РНК – полимераза

         б) ТАТА – фактор

         в) факторы инициации

         г) факторы элонгации

         д) факторы терминации

8. Биологический код – это….

а) порядок чередования нуклеотидов ДНК

б) порядок чередования нуклеотидов рРНК

в) способ записи первичной структуры белка с помощью последовательности нуклеотидов мРНК и ДНК

г) набор генов, определяющий фенотипические признаки

д) триплет нуклеотидов, кодирующих одну аминокислоту

Эталоны ответов на тесты:

1. – а, б; 2. – в; 3. – а, б; 4.– г, д; 5. - а, б, в, д; 6.- а, б; 7.– а, б, в; 8 – д.