Работа № 1. Колориметрический метод определения активности аспартат- и аланинаминотрансфераз в сыворотке крови.

    Определение активности аминотрансфераз в сыворотке крови имеет важное значение для диагностики болезней печени. Для острого гепатита характерно раннее повышение активности аланинаминотрансферазы (АлАТ). При инфаркте миокарда в 95 % случаев в сыворотке крови повышается активность аспартатаминотрансферазы (АсАТ). В сыворотке крови здоровых людей активность АсАТ колеблется в пределах 0,028-0,139 мкмоль/л×сек, активность АлАТ – 0,028-0,196 мкмоль/л×сек.

Принцип метода.В результате переаминирования при участии АсАТ и АлАТ образуются, соответственно, щавелевоуксусная (ЩУК, оксалоацетат) и пировиноградная (ПВК) кислоты.

СООН         СООН                   СООН                  СООН

 |                    |                     |                      |

СН–NH₂ +  C=O                      C=O   +   СН–NH₂

 |                    |            ←→    |                   |

CH₂                       (CH₂)₂         АсАТ CH₂                      (CH₂)₂

 |                    |                              |                         |

COOH          COOH                  COOH               COOH

аспартат  α-кетоглутарат      оксалоацетат     глутамат 

СООН         СООН                   СООН                  СООН

 |                    |                     |                      |

СН–NH₂ + C=O                      C=O   +   СН–NH₂

 |                    |            ←→    |                   |

CH₃                       (CH₂)₂         АлАТ CH₃                      (CH₂)₂

                      |                                                             |

                     COOH                                                  COOH

аланин    α-кетоглутарат       пируват              глутамат 

Оксалоацетат при декарбоксилировании превращается в пируват. При добавлении кислого 2,4-динитрофенилгидразина ферментативный процесс останавливается и образуется гидразон пировиноградной кислоты. Последний в щелочной среде дает окрашивание, интенсивность которого пропорциональна количеству образовавшейся пировиноградной кислоты.

Техника выполнения работы.

Определение АсАТ.

Одновременно готовят опытную и контрольную пробы.

Опытная проба. В пробирку вносят 0,5 мл субстратного раствора, добавляют 0,1 мл сыворотки, помещают в термостат при температуре 37° С на 1 час. Затем добавляют 0,5 мл раствора динитрофенилгидразина и выдерживают при комнатной температуре 20 мин для развития реакции. Затем приливают 5 мл 0,4 н NaOH, тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 10 мин для развития окраски. Оптическую плотность измеряют на ФЭКе с зеленым светофильтром в кювете на 10 мм против контроля.

Контрольная проба. Содержит все ингредиенты опытной пробы за исключением сыворотки крови. Вместо нее берут 0,1 мл дистиллированной воды и инкубируют в тех же условиях, что и опытную.

Определение АлАТ.

Одновременно готовят опытную и контрольную пробы.

В опытную пробирку вносят 0,5 мл субстратного раствора для определения АлАТ, затем добавляют 0,1 мл испытуемой сыворотки и помещают в термостат при температуре 37° С на 30 мин. Дальнейший ход анализа такой же, как при определении АсАТ.

В контрольную пробирку вместо сыворотки крови берут 0,1 мл дистиллированной воды.

Расчет активности ферментов производят по калибровочному графику, отражающему зависимость оптической плотности от содержания ПВК.

Работа № 2. Количественное определение мочевины в моче по Рашковану.

Принцип метода.Основан на том, что мочевина с гипохлоритом натрия и фенолом образует продукт зеленого окрашивания.

Ход работы. В пробирку поместить 0,1 мл разведенной в 100 раз исследуемой мочи, добавить 7 мл этилового спирта и прилить 2 мл дистиллированной воды. К полученной смеси прибавить 1 мл 0,035 н раствора НСl, тщательно перемешать, добавить 1 мл 1,2 % NaOCl, вновь тщательно перемешать и сразу же добавить 1 мл 5 % раствора фенола. Содержимое пробирки хорошо перемешать и поместить на 25 мин в термостат при температуре 55-60° С.

Окрашенный в зеленый цвет раствор охладить и колориметрировать на ФЭКе с красным светофильтром в кюветах толщиной 5 мм против воды.

Концентрацию мочевины рассчитать с помощью калибровочного графика с учетом разведения мочи и суточного диуреза (1500-2000 мл).

Эталоны ответов на тесты

Вид 1. 1.1. – б; 1.2. – в;

Вид 2. 2.1. 1- в; 2-а; 3-б;

       2.2. 1вд; 2аб; 3е; 4-г.

Вид 3. 3.1. - А, Д; 3.2. а-2, б-3, в-1.

Вид 4. 4.1. – Д (-, +, -); 4.2. – А (+, +, +).

Эталоны ответов на ситуационные задачи

Задача 1.Практикант Б. прав. Вследствие токсического действия органических растворителей могло произойти повышение проницаемости мембран клеток печени и выход ферментов в кровь.

Задача 2.Фенилпировиноградная олигофрения. Нарушение обмена фенилаланина – дефект фенилаланингидроксилазы. Рекомендуется диета с исключением фенилаланина.

Занятие №3. Матричные синтезы ДНК, РНК, белка (семинар).

Цель занятия.Закрепить представления о биосинтезе нуклеиновых кислот и белка, механизмах регуляции биосинтеза белка, действии мутагенных факторов.

Содержание занятия.

Студентам предстоит дать ответы на тесты контроля исходного уровня знаний и вопросы преподавателя, решить ситуационные задачи и прослушать доклады по теме УИРС.