Работа № 1. Определение концентрации глюкозы в сыворотке крови глюкозооксидазным методом.

Принцип метода.Глюкоза в присутствии фермента глюкозооксидазы окисляется кислородом воздуха с образованием пероксида водорода, при разрушении которого под влиянием пероксидазы происходит конденсация фенола и p-аминоантипирина в окрашенное соединение. Реакция протекает по схеме:

Глюкоза + О₂ + Н₂О ¾¾¾¾¾¾¾¾® глюконат + Н₂О₂;

                                       ^{глюкозооксидаза}

2Н₂О₂ + фенол + 4-аминоантипирин -¾¾® 4(n-бензохинонмоно- + 4Н₂О.

               (п-аминофеназон)  ^{пероксидаза}     имино)-феназон

                                                                 (цветной хиноимин)

Интенсивность окраски раствора пропорциональна концентрации глюкозы в крови.

Ход работы:1. В пробирки внести реактивы в соответствии с указанными объемами:

Пробы перемешивают и инкубируют 30 мин. в термостате при 37⁰С. Измеряют оптическую плотность опытной (Е₁) и стандартной пробы (Е₂) против контрольной в кювете 0,5 см, при длине волны 480-520 нм. Измерение должно быть проведено до истечения 5 минут.

Содержание глюкозы определяют путем расчета по формуле:

С глюкозы (ммоль/л) = Е₁/Е₂ ×10

Сопоставить с нормой содержания у здоровых людей и сделать вывод.

Работа № 2. Определение глюкозы в крови по цветной реакции с орто-толуидином.

Принцип метода. Белки крови осаждаются трихлоруксусной кислотой и отделяются центрифугированием. Центрифугат обрабатывается орто-толуидиновым реактивом.

 Глюкоза при нагревании с о-толуидином в кислой среде дает зеленое окрашивание, интенсивность которого прямо пропорциональна концентрации глюкозы в крови и определяется колориметрически на ФЭКе.

Ход определения. В центрифужную пробирку налить 0,9 мл 3% раствора трихлоруксусной кислоты и выдуть на стенку пробирки 0,1 мл крови, взятой из пальца. Содержимое пробирки взболтать и центрифугировать 5-7 мин при 1500 об/мин.

Взять две пробирки. В первую (опыт) прилить 0,5 мл центрифугата, во вторую (контроль) - 0,5 мл 3% раствора трихлорукусусной кислоты и в обе пробирки добавить по 4,5 мл 0-толуидинового реактива. Пробирки поместить на 8 мин (точно!) в кипящую водяную баню и сразу охладить под водопроводной водой до комнатной температуры.

Опытную пробу колориметрировать против контроля или дистиллированной воды на ФЭКе в кювете толщиной слоя 10 мм при красном (600-650 нм) или желтом (595 нм) светофильтре.

Расчет произвести по калибровочному графику или с применением стандартного раствора глюкозы.

Стандартная проба.Стандартную пробу проводят как опытную, но вместо крови используют стандартный раствор глюкозы с концентрацией 5,55 ммоль/л (1,0 г/л), а в случае высокого содержания сахара в крови 16,65 ммоль/л (3,0 г/л) или 27,75 ммоль/л (5,0 г/л).

Расчет произвести по формуле:

С_оп = (С_ст × Е_оп) / Е_ст =  ммоль/л глюкозы или г/л глюкозы, где

С_оп - концентрация глюкозы в опытной пробе в ммоль/л или г/л,

С_ст - концентрация глюкозы в стандартной пробе в ммоль/л или г/л,

Е_оп - оптическая плотность опытной пробы,

Е_ст - оптическая плотность стандартного раствора глюкозы.

Работа № 3. Качественное обнаружение глюкозы в моче при помощи индикаторной бумаги «Глюкотест».

Принцип метода. “Глюкотест” приготавливается путем пропитки полосок фильтровальной бумаги 0,5х5 см смесью, содержащей глюкозооксидазу, пероксидазу и краситель. При смачивании бумаги раствором, содержащим глюкозу, происходит окисление глюкозы под действием фермента глюкозооксидазы. Образующаяся при этом перекись водорода разлагается ферментом пероксидазой с окислением содержащего в тесте красителя. Интенсивность изменения окраски в определенной степени пропорциональна содержанию глюкозы в растворе, поэтому “Глюкотест” используется и для полуколичественного определения содержания глюкозы в моче (от 1,0 до 20 г/л и выше).

Ход работы. Бумажку “Глюкотест” погрузить в исследуемую мочу так, чтобы нанесенная на бумажку желтая полоса была смочена. Немедленно извлечь бумажку, положить смоченным концом на пластмассовую пластинку и через 2 мин сравнить изменившуюся окраску цветной полосы со шкалой, имеющейся в комплекте. Содержание глюкозы в моче определяют по наиболее совпадающему со шкалой цвету полоски.

Клинико-диагностическое значение определения содержания глюкозы в моче.В моче здорового человека глюкоза практически не обнаруживается. В суточном количестве мочи может содержаться до 125-130 мг глюкозы. Почечный порог глюкозы зависит от величины гипергликемии, продолжительности ее, состояния почек и многих других причин. Различают гипергликемическую глюкозурию и нормогликемическую. Концентрационный почечный порог – предельно низкая концентрация вещества, при которой оно появляется в моче - для глюкозы – 9-10 ммоль/л. Нормогликемическая глюкозурия связана, главным образом, с нарушением реабсорбции глюкозы в почечных канальцах.

Работа № 4. Определение активности альфа-амилазы в сыворотке крови и моче.

Принцип метода. Альфа-амилаза катализирует гидролиз нерастворимого цветного крахмального субстрата с образованием синего растворимого в воде красителя. Количество освобожденного красителя пропорционально активности фермента.

Ход определения. Для определения активности альфа-амилазы в сыворотке крови или моче готовят параллельно опытную и контрольную пробы и анализируют в следующей последовательности:

Пробы перемешивают, оставляют стоять на 15 мин, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. Затем измеряют оптическую плотность опытной пробы против контрольной на ФЭКе при длине волны 590 нм в кюветах с толщиной слоя 5,0 мм.

Активность фермента находят по калибровочному графику.

Клинико-диагностическое значение определения активности альфа-амилазы в сыворотке крови и моче:у человека альфа-амилаза секретируется поджелудочной и слюнными железами, небольшая ее активность обнаруживается в ткани печени и скелетной мускулатуры. Молекулярная масса фермента относительно низка (»48000), поэтому он фильтруется в клубочках почек и содержится в моче.

У здоровых людей в сыворотке активность фермента от 140 до 350 Е/л, в моче - от 1000 до 2000 Е/л. Активность амилазы увеличивается, главным образом, при заболеваниях поджелудочной железы (при остром панкреатите). К повышению активности альфа-амилазы сыворотки крови приводят заболевания слюнных желез, хронические заболевания почек.

Работа № 5. Влияние адреналина на содержание глюкозы в крови.

Ход работы. У кролика из краевой вены уха или у крысы из хвостовой вены набирают 0,1 мл крови и определяют о-толуидиновым методом содержание глюкозы в крови.

Затем у животного выстригают на боку шерсть, протирают кожу спиртом и водят подкожно 0,1 % раствор адреналина из расчета 0,1 мл на 1 кг веса и через 30 минут повторно определяют содержание глюкозы в крови.