Принципы создания сред для культивирования эмбрионов млекопитающих и человека.

Есть два принципа разработки культуральных сред:

1) “let the embryo choose” делается эмпирический подбор компонентов для получения наибольшего успеха. В случае эмбрионов – для получение наибольшего % развития (до стадии бластоцисты). Используется для эмбрионов лабораторных животных (мыши, крысы) так как потери какого-то количества эмбрионов не так страшны.

2) “Back to Nature” для этого исследуется та среда, в которой эмбрион развивается in vivo, определяется компонентный состав. Где эмбрион развивается? В основном в яйцеводе. Там внутри есть жидкость. Ее можно получить и проанализировать все что там есть. После этого можно сделать среду максимально похожую на эту. То есть для этого принципа нужно знать состав фолликулярной жидкости у того вида животного, эмбрионы которого мы хотим культивировать. Хорошо подходит для редких животных, чтобы потери были минимальными.

Как же создавались среды для эмбрионов? Самые старые среды – это для эмбрионов мышей и они создавались по принципу “let the embryo choose” .

История создания сред для культивирования.

1956 год – Whitten. Он культивировал эмбрионы миши с 8-ми клеток до бластоцисты. В его среде было только 8 компонентов, растворенных в воде. Потом какое-то время он модифицировал среду, заменял хлорид кальция на лактат кальция. Это самая первая работа. Далее были Biggers и McLaren. Они первые провели полный цикл. Сделали свою пропись среды. Культиворовали с 8-ми клеток, пересадили суррогатной матери и у них родились мышата. Далее Biggers занимался разработками сред, а McLaren занималась эмбриологией млекопитающих и бывала даже в Москве (и на кафедре). Следующий автор – Brinster. Его работы лежат в основе создания сред для эмбрионов. Он занимался конкретно разработкой сред. Изучал влияние состава сред на развитие эмбрионов. Заложил основы промышленного производства сред. В частности, изучал воздействие источников энергии (глюкозы, лактата и пирувата) на развитие эмбрионов. Смотрел также влияние газовой фазы и влияние осмолярности среды. Есть работы о том как эмбрион поглощает высоко- и низкомолекулярные компоненты среды. Как меняется эффективность работы энергетической системы эмбриона при изменении кислородной фазы.

Стадии преимплантационного развития эмбрионов мыши; эмбрионы в половых путях самки.

8. Методы получения эмбрионов мыши определенных стадий развития. Точность датирования стадий развития эмбрионов.

Плодовитость - 14 месяцев, половое созревание наступает ко второму-третьему месяцу жизни. В среднем за жизнь самочка даёт около 100 детёнышей (если считать, что в помёте по 10 мышат). Для того, чтобы точно узнать сроки беременности - подсаживают самок к самцам (независимо от стадий эстрального цикла) - если есть влагалищная пробка - беременность. Влагалищная пробка - конгломерат из жидкой части спермы и слущенных клеток эпителия влагалища. Если малое стадо - берут самок на стадии эструса (овуляция) и подсаживают к самцам. Можно провести гормональную стимуляцию: вкалывают ФСГ в дозировке 2,5-5 МЕ, затем, через двое суток ХГ. Так же важно, что иногда бывает спонтанная гибель зародышей до имплантации.

Стадии: эструс (чешуйки неправильной формы без ядер, 12ч), метаэструс (клетки, чешуйки, лейкоциты, 24ч), диэструс (много слизи, лейкоциты, 2,5сут), проэструс (эпителиальные клетки с ядрами, 12ч).

Стадии беременности мышей - 0,5 сут после спаривания - зигота, клетки находятся в ампулярной части яйцевода, каждая яйцеклетка окружена кумулюсными клетками, которые достаточно липкие. 1,5 суток - стадия 2-х бластомеров, окружены zona pellucida, 2,5 суток - морула, 3,5 - бластоциста в zp, 4,5 - бластоциста без zp, имплантация, видимо. Если у нас эмбрионы зиготы до 2,5 суток, то вымывать их нужно из яйцеводов, если это 3-3,5 суток то их рогов матки. Пересаживают эмбрионы от 2,5 суток и старше мы пересаживаем в рог матки, а зиготу и дробление пересаживаем в воронку яйцевода.

9. Лабораторные методики получения псевдобеременных самок. Применение псевдобеременных самок в эмбриологическом эксперименте.

Для получения псевдобеременных самок, молодых, половозрелых самочек (желательно на стадии эструса - повышается вероятность забеременеть) ссаживают с половозрелыми, стерильными самцами. Самцов заблаговременно вазэктомируют. Для этого можно использовать перевязку, перерезку или пережигание семявыносящего канальца. Наиболее удачным методом является именно пережигание, так как концы канальца не срастаются, а значит, самец навсегда остается стерильным. Целесообразно использовать стерильных самцов около года, так как после этого периода у них понижается гормональная функция семенника и они меньше хотят телочек. Лучше всего использовать самцов линии Такона, потому что у них наивысшее половое влечение из всех линий. Если очень необходимы овулирующие мыши можно применить гормональную стимуляцию, за 2-3 суток до спаривания. Мыши получают инъекцию ФСГ в размере 2,5 МЕ (в зависимости от веса), через двое суток в той же дозировке хорионический гонадотропин. После псевдооплодотворения образует желтое тело псевдобеременности. У самки может развиться лактация, разрастаются маточные железы, они начинают строить гнезда для будущего потомства.

Для чего же необходимы псевдобеременные самки? При создании трансгенных животных необходима пересадка эмбрионов рецепиенту. У донора мыши забирают эмбрионы на необходимой стадии, проделывают с ними определенные манипуляции, а затем подсаживают псевдобеременной мыши. Чтобы убедиться, что действительно произошла пересадка используют мышей разных цветов. Так же на этих стадиях делают трансгенных животных. 1-я методика – это когда инъецируют плазмиду в пронуклеус зиготы. 2-я методика – это когда делают трансформированную клеточную линию – эмбриональных стволовых клеток уже несущую трансген и потом дедают химерных эмбрионов. Эти клетки просто инъецируют в полость бластоцисты. И то и другое делают при помощи микроманипулятора. И ещё можно тестировать среды, embryo tested.

Что же можно делать с полученными ранними эмбрионами? Мы можем вымыть эмбрион, что-то с ним сделать, а потом пересадить эти эмбрионы псевдобеременной самке. У мышей гормональный статус ранней беременности наступает не потому, что у мыши в яйцеводах есть нормальные эмбрионы, а потому что мышь спарилась с самцом. Т.е. после спаривания у мыши начинается перестройка организма, такая как при нормальной беременности. Раз она спарилась, значит овуляция произошла, желтые тела нормально работают, лютеиноциты дифференцируются, прогестерон вырабатывается, матка готовится к имплантации. И следующий сигнал в матку идет уже от сформировавшейся бластоцисты, когда она начинает готовить место для себя, выделяя некоторые вещества (тропобластин у мышей). В связи с этим была разработана такая методика. Мышь спаривают с вазэктомированным самцом. У такого самца перевязаны семявыводящие протоки. Эмбрионы псевдобеременной мышке можно пересадить либо в воронку яйцевода либо в рог матки.

10. Методы трансплантации эмбрионов мыши; выбор метода в зависимости от стадии развития эмбриона[1] [2] .

Для работы с эмбрионами необходимо учитывать стадию развития эмбриона. Важно трансплантировать эмбрион хотя бы примерно в то место, откуда он был изъят.

Ход операции: мышь донора забивают, вскрывают брюшную полость ( разрываем кожу, чтобы было меньше волос). В зависимости от стади беременности находим нужную часть. На ранних стадиях необходима ампулырная часть яйцевода, на поздних - рога матки ( хотя таких маловероятно, что модно пересадить). Извлекаем яйцевод, переносим в часовое стекло со средой, дабы очистить от крови и жира. После предварительной очистки яйцевод переносится в новое часовое стекло для получения эмбрионов. Разрезав стенку яйцевода получаем с током жидкости наши зародыши. Переносим их в капли среды с помощью микропипетка, проводим по 5-6 каплям, оставляем в капле, под маслом. Готовим мышь рецепиента: мышь получает наркоз, необходимо рассчитывать дозу на массу животного. На брюшной полости делаем разрез, микропипетку вставляем в ампул нуб часть яйцевода и вводим туда эмбрионы. Важно ввести их именно в полость, а не загнать в мышечный слой - тогда их будет невозможно вымыть ( если захотим) или они не имплантируются, разовьется сепсис - мышь умрет. 

Стадии беременности мышей - 0,5 сут после спаривания - зигота, клетки находятся в ампулярной части яйцевода, каждая яйцеклетка окружена кумулюсными клетками, которые достаточно липкие. 1,5 суток - стадия 2-х бластомеров, окружены zona pellucida, 2,5 суток - морула, 3,5 - бластоциста в zp, 4,5 - бластоциста без zp, имплантация, видимо. Если у нас эмбрионы зиготы до 2,5 суток, то вымывать их нужно из яйцеводов, если это 3-3,5 суток то их рогов матки. Пересаживают эмбрионы от 2,5 суток и старше мы пересаживаем в рог матки, а зиготу и дробление пересаживаем в воронку яйцевода.

11. Формирование морулы.

Напомню предыдущие события развития: ооцит, высвободившись из яичника, направляется в яйцевод слабым током жидкости, создаваемым бахромчатым краем воронки яйцевода. Оплодотворение происходит в воронке - ближайшем к яичнику отделе яйцевода. В это время в оплодотворенном яйце завершается мейоз, и спустя сутки начинается первое деление дробления. Млеки являются довольно медленно дробящимися особями относительно всего животного царства. Между тем, ворсинки яйцевода продвигают зародыш по направлению к матке: во время этого продвижения происходят первые деления дробления. Помимо 1) замедленных клеточных делений есть еще несколько особенностей дробления: 2) уникальная ориентация бластомеров друг относительно друга. Если первое деление дробления обычно меридиональное, то при втором делении один из двух бластомеров делится меридионально, другой- экваториально. Этот тип дробления- ротационный; 3) выраженная асинхронность первых клеточных делений: бластомеры млеков не делятся одновременно, именно поэтому они часто могут содержать и нечетное кол-во клеток; 4) геном млеков активирован во время раннего дробления и продуцирует белки, необходимые для нормального протекания дальнейшего развития; 5) явление компактизации. Бластомеры мышиного зародыша на 8кл. стадии лежат довольно рыхло и контактируют друг с другом небольшими участками поверхности, однако, по ходу 3 деления дробления поведение бластомеров изменяется: они внезапно слипаются, S их контакта друг с другом максимально ↑, они формируют компактный шарик (сферу) клеток. Такая плотная упаковка бластомеров стабилизируется плотными контактами, которые формируются между внешними клетками сферы, изолируя внутр. часть этой сферы. Клетки внутри сферы образуют щелевые контакты, пропускающие небольшие молекулы и ионы. Клетки компактизованного 8-клеточного зародыша делятся и образуют 16-кл. морулу. Морула (от лат. Morulae – тутовая ягода) представлена небольшой группой внутр. клеток, окруженных большой группой наруж. клеток. Большая часть потомства наружных клеток → кл. трофоэктодермы (формируют ткань хориона- зародышевой части плаценты). Мышиный зародыш - из потомства внутр. кл. 16-кл. стадии, состав которых может пополниться кл, отделившимися от трофобласта при переходе к 32 кл. стадии. Все эти кл. образуют внутреннюю клеточную массу (ВКМ), которая даст начало зародышу и связанным с ним желточному мешку, аллантоису и амниону. К 64 кл. стадии ВКМ (около 13 клеток) и кл. трофобласта становятся самостоятельными клеточными слоями, не обменивающимися клеками друг с другом. ВКМ поддерживает трофобласт путем секреции белков (например, FGF4), которые стимулируют деления его клеток. После того, как выбор сделан (быть трофобластом или ВКМ), в клетках возникают различия в экспрессии генов: ВКМ продолжают экспрессировать Oct4- ТФ, связанный с плюрипотентностью, кл. трофобласта синтезируют ТФ эомезодермин- активирует специфические белки трофобласта. Морула не имеет внутр. полости, у мышек образуется на 2,5 день развития,  именно на этой стадии in vivo (в организме матери) эмбрион попадает из маточной трубы в полость матки. У человека морула- на 4 сутки.

12. Формирование бластоцисты.

Как уже было сказано, морула не имеет внутренней полости. Однако вскоре начинается процесс кавитации, в ходе которого клетки трофобласта секретируют в морулу жидкость, вследствие чего в моруле начинает формироваться бластоцель. Мембраны клеток трофобласта содержат обращенный в полость натриевый насос (Na/K- АТФазу), этот трансмембранный белок накачивает в центральную полость ионы натрия. Накопление ионов натрия ведет к осмотическому поступлению воды, увеличивая полость. В результате кавитации все клетки ВКМ окажется на одной стороне внутренней поверхности шарика, образованного клетками трофобласта. В сформированной бластоцисте принято различать муральный трофобласт, образующий стенку полости, и полярный трофобласт, покрывающий эмбриобласт. Трофобласт в последующем даст разнообразные исключительно внезародышевые структуры, активно участвующие в имплантации зародыша в эндометрий матки и составляющие плодную часть плаценты. Эмбриобласт состоит из тотипотентных клеток, представляющих не только эмбриональные стволовые линии зародыша, но и дающих материал некоторых внезародышевых структур.

Сформировавшаяся структура (бластоциста) является еще одним этапом дробления млекопитающих. По мере того, как зародыш продвигается по яйцеводу к матке, бластоциста занимает все большую часть пространства внутри zona pellucida. В течение всего этого времени zona pellucida препятствует прилипанию бластоцисты к стенкам яйцевода. Если все-таки такая адгезия происходит → внематочная беременность. У мышек на Е3,5. У человека на 5-6 день, именно тогда перенос бластоцисты имеет большую частоту успешной имплантации,  позволяя переносить меньшее количество эмбрионов высокого качества, снижать риск многоплодной беременности при увеличении частоты наступления беременности.

13.Дифференцировка клеток внутренней клеточной массы бластоцисты.

       Вскоре после образования бластоцисты на поверхности ВКМ, обращённой в полость дифференцируется третья линия клеток – гипобласт или первичная эндодерма (внезародышевая). Эти клетки покидают зародышевый узелок либо путём ингрессии (выселение,миграция клеток по отдельности из поверхностного слоя) либо в результате деламинации (расслоение) и распространяются по внутренней поверхности мурального трофобласта. Эта популяция клеток производит только внезародышевую эндодерму. После выделения гипобласта, оставшаяся часть ВКМ называется эпибластом и включает линии клеток зародыша и клеток, дающих внезародышевую мезодерму. В слое эпибласта появляются небольшие щели, которые затем сливаются, формируя полость, отделяющую зародышевый эпибласт от тех кл. эпибласта, которые будут ее выстилать, эта полость соответствует амниотической полости. После образования амниона полость заполняется амниотической жидкостью, которая выполняет защитную функцию и препятствует высыханию.

С помощью мечения индивидуальных кл. эпибласта пероксидазой хрена Лоусон удалось создать карту презумптивных зачатков эпибласта мыши (рис.) Гаструляция начинается на заднем конце зародыша, здесь же формируется узелок. Мезодерма и энтодерма млекопитающих мигрируют через первичную полоску. Мигрирующие клетки эпибласта утрачивают Е-кадгерин, теряют связь с соседями и выселяются из дна полоски независимо друг от друга. Клетки, мигрирующие через узелок, дадут хорду. Интересно, что сначала клетки, формирующие хорду у мыши оказываются в составе слоя клеток энтодермы первичной кишки. Эктодермальные предшественники локализованы впереди полностью сформированной (удлиненной) первичной полоски.