Механизмы реципрокной индукции.

В процессе индукции мезонефроса изменяется обе ткани. Можно выделить 8 ключевых наборов сигналов, обеспечивающих реципрокную индукцию метанефроса.

1 этап - формирование метанефрогенной мезенхимы. Метанефрогенная мезенхима не может стать никакой другой тканью, кроме нефронов. Характеризуется транскрипционными факторами Hoxa11, Hoxc11, Hoxd11(без них нет индукции зачатка мочеточника), WT1(без него нет компетенции к ответу на индукторы мочеточника и неиндуц.кл. погибают).

2 этап метанефрогенная мезенхима секретирует GDNF и HGS, индуцируя и направляя развитие зачатка мочеточника. Вторым сигналом к развитию почки служит набор молекул, который вызывает ответвление от почечных протоков двух зачатков мочеточника. GDNF синтезируется в метанефрогенной мезенхиме с рецепторами в почечных протоках, которые позже концентрируются в растущих зачатках мочеточника.

3 этап зачаток мочеточника секретируют FGF2 и BMP7, чтобы предотвратить апоптоз мезенхимы. Третий сигнал, регулирующий развитие почки, идет от зачатка мочеточника к метанефрогенной мезенхиме. Без этого мезенхимальные клетки уходят в апоптоз, индукция зачатком мочеточника может превратить их в пролиферирующая стволовые клетки. Фактор gf2 - ингибирует апоптоз, способствует конденсации мезенхимальных клеток и поддерживает синтез wt1. BMP7 - действует сходным образом, без него мезенхима уходит в апоптоз.

4 этап LIF и wnt 6, источником которых служит зачаток мочеточника, индуцируют агрегацию мезенхимальных клеток. Зачаток мочеточника вызывает изменения в клетках метанефрогенной мезенхимы, превращая их в эпителий. Новоиндуцированная мезенхима синтезирует е-кадгеин, ведущий к слипанию клеток в агрегаты. Такие узелки мезенхимы начинают синтезировать эпителиальную базальную пластинку с коллагеном 4 типа и ламинин и превращаются в эпителий. LIF - превращение мезенхимальные агрегаты в эпителий(при условии предварительного воздействия FGF2). Wnt6 - конденсация мезенхимы FGF-независимым способом.

5 этап wnt4 превращает агрегировавшие мезенхимальные клетки в нефрон. Мезенхима которая, приступила к конденсации, начинает секретировать Wnt4, который действует аутокринным способом, завершает переход от мезенхимной клеточной массы в эпителий(без него, мезенхима конденсируется, но не превращается в эпителий.) Lim1 обнаружен в конденсированных клетках мезенхимы.

6 этап сигналы, идущие от мезенхимы, индуцируют ветвление зачатка мочеточника. Ветвление связано с активностью паракриных факторов, действующих по принципу тяни-толкай. Некоторые способствуют сохранению внеклеточного матрикса, другие способствуют ветвлению и переваривают внеклеточный матрикс. GDNF - индуцирует не только первичное(в самом начале), но и вторичное ветвление уже в метанефрогенной мезенхиме. TGF-beta1 стимулирует синтезы во внеклеточном матриксе и ингибирует металлопротеиназы, переваривающие матрикс. BMP4 - есть в мезенхимальных клетках, его рецепторы в эпителиальных. Локализует образование почек. Коллаген 8. Специфичность характера ветвления. Есть на ответвлениях эпителия, но нет на их верхушках.

7 и 8 этап: дифференцировка нефрона и рост зачатка мочеточника. Описанное выше приводит к образованию метанефрогенной мезенхимы и конденсации клеток лоханки дефинитивной почки, покрывающей дистальные концы ответвлений зачатка мочеточника. Клетки такого агрегата образуют предканальцевое сгущение, или предканальцевую конденсацию, она дает начало секреторному нефрону почки. Клетки лоханки секретируют Foxb2(без него нет древовидного разветвления мочеточника), превращают витамин А в ритиноевую к-ту, которая поддерживает экспрессию Ret(один из рецепторов GDNF). Также секретируют фактор роста FGF7(обеспечивает поддержание эпителия)

Раздел «Млекопитающие, преимплантационное развитие»

Виварий для эмбриологических исследований: основные методы работы с животными

В виварии мыши размещаются в клетках, устанавливаемых на металлических стеллажах. Максимальное число животных 15. В каждом отдельном помещении рекомендуется содержать животных только одного вида. Если по условиям эксперимента необходимо совместное содержание лабораторных животных разных видов в одной секции, то их следует размещать на разных стеллажах. На каждой клетке должна быть этикетка с указанием данных о животном и сроках эксперимента.

Пополнение вивария животными производится из специализированных питомников, благополучных по инфекционным заболеваниям. Самые доступные у нас линии мышей: CBA и DBA, C57/BL, Bulb С- альбиносы, SHK, ICR – аутбредные, с высоким числом овулирующих ооцитов. А также гибриды, например, C57/BL×CBA.

Кормление лабораторных животных осуществляется полнорационным гранулированным комбикормом. Снабжение лабораторных животных питьевой водой производится из водопровода. Крысы и мыши содержатся в клетках прямого контакта с подстилкой. В качестве подстилки рекомендуется использовать опилки, стружки или мелкую щепу из экологически чистой древесины лиственных пород. Меняют подстилку в клетках 1-2 раза в неделю. Комнаты содержания животных имеют 12-ти часовой цикл освещения с автоматическим включением и выключением света.

Все действия, которые могут причинить лабораторным животным производятся с использованием наркотизирующих средств. Если по условиям эксперимента противопоказано применение анестезии, то все вышеуказанные действия необходимо проводить в максимально короткий срок. Анестезия проводится до привязывания животного к станку. Расчет количества анестезирующего вещества на 1 кг или 1 г массы животного. Существует несколько методов эвтаназии экспериментальных животных – это физические и химические. Физические методы включают оглушение, декапитацию и перелом шейных позвонков. Химические методы включают ингаляционные средства (такие как СО, СО₂), летучие обезболивающие средства (галотан, энфлуран и др.) и снотворные (барбитураты и ряд др.). Эвтаназия мышей осуществляется углекислым газом в течение 10 мин., шейной дислокацией, фентобарбитон 5% раствор 0,5мл и/п. Умерщвление мышейпроизводят также эфиром, хлороформом, пропусканием через головной мозг электрического тока. В исследованиях на животных возникает вопрос надежной фиксации отдельных частей их тела или всего животного в целом. Для иммобилизации животных их прикрепляют к специальному столику в положении на спине.