Среды для культивирования эмбрионов млекопитающих простого состава.

Те среды, которые мы используем и для эмбрионов и для клеток называются CDM (chemically defined medium) - среда определенного химического состава. Раньше очень часто использовали сыворотку крови, т.е не могли точно сказать состав среды. Какие же плюсы у CDM? Во-первых, она может быть приготовлена по прописи в любой лаборатории, т.е берем хорошие реактивы, хорошую воду и хорошие весы, все взвешиваем (компонентов может быть 10 и больше). Во-вторых, можем проводить оптимизацию сред под наши задачи, то есть изменить содержание любого компонента среды.

Это часто делают фирмы, которые разрабатывают среды под определенные клеточные типы или линии. Кроме того в таких средах отсутствуют незапланированные биоактивные вещества: ферменты, гормоны, ростовые факторы и тд. То есть то, что может каким-то неправильным образом влиять на наши клетки или эмбрионы. И также если это незапланированные биоактивные вещества, то нельзя оценить их количество от партии к партии. В том же случае если мы их добавили сами, то мы точно знаем сколько их у нас в среде.Используют также методы математического моделирования для оптимизации сред.

В составе среды Бринстера 10 компонентов: различные соли, глюкоза, бычий сыворотночный альбумин.

NaHCO₃ – добавляют для балансировки с воздушной средой (по СО₂). Большая часть сред сбалансирована на 5% СО₂.

Бычий сыворотночный альбумин или другие сыворотки также важный компонент. Важны также энергетические добавки. Сейчас среды бывают 2-х вариантов. Среды, в которые добавлены все три субстрата (пируват, лактат и глюкоза). Но есть некоторые данные, что глюкоза тормозит развитие эмбрионов и часть фирм выпускает двухэтапные среды: от зиготы до дробления, и с морулы до бластоцисты. Также есть такие варианты: для оплодотворения (пируват в основном), для дробления (пируват и лактат), для бластоцист (глюкоза).

Еще в современные среды добавляют антибиотики. И цветовой индикатор – феноловый красный. Индикатор показывает рН среды. До рН 6.8 – лимонно желтый, 6.9-7 – цвет разведенной крови, 7.1-7.25 – розовый оттенок, выше 7.35 – пурпурный оттенок. Если в кислую сторону уходит рН – значит или зарост или просто много клеток и они начинают гибнуть. Если в щелочную – то возможно проблемы с инкубатором. Когда достаем чашку из него, то тоже среда уходит в щелочную сторону.

В чем культивируют эмбрионы? Во всем! Чашки Петри с каплями под маслом, капилляры стеклянные, маленькие лунки, висячая капля и тд. Масло должно быть сбалансированно относительно солевого состава среды. Сейчас используют в основном две системы для культивирования: культивирование в каплях и культивирование в четырехлуночных плашках.

М-16 стандартная среда для культивирования эмбрионов (с бикарбонатом натрия).

М-2 для манипуляций на воздухе (вместо бикарбоната натрия используется буферная система HEPES-NaOH). Эмбрионы плохо переносят высокое содержание фосфатов в среде.

Как выбрать нужные компоненты? Эмпирически. Менять один компонент и смотреть результат. Часто используется модель последовательной оптимизации. Может быть несколько зон оптимальности, так как разные компоненты по разному взаимодействуют. SOM - simplex optimisation method. Есть компьютерные программы для оценки совместного влияния нескольких компонентов.

Какие компоненты могут быть? Разные. Не всегда среда должна иметь только те компоненты, которые содержаться в трубной жидкости. Можно модифицировать. HTF - human tubal fluid. Это среда разработана на основе очень ограниченного кол-ва данных. Было мало образцов.

Осмотические свойства среды. Почему под маслом культивируют? Потому что, если среда подсыхает, то концентрация солей увеличивается и увеличивается значение осмолярности. Гипертонические растворы это больше 300 мОсмоль (миллиосмоль), гипотонические – меньше 300 мОсмоль. Если работаем с маленькой каплей, то она сохнет. Поэтому капля либо около 1 мл, либо покрыть минеральным маслом. Изменение осмолярности видимо важнее для эмбриона, чем температура или газовая фаза.

Усвоение преимплантационными эмбрионами энергетических субстратов.

Первый, кто написал, что компонентный состав энергетических добавок важен для эмбрионов – это Бринстер (1967-1969 года работы). У нас есть три источника энергии: пируват, лактат и глюкоза. Как правило это натрий пируват, натрий или кальций лактат. Глюкоза превращается в пируват и энергия получается за счет цикла пирувата. У всех млеков ооциты и зиготы умеют усваивать только пируват. С 2-х клеточной стадии эмбрионы начинают понемногу утилизировать лактат и начиная с компактизированной морулы эмбрионы способны утилизировать глюкозу (т.е. начинают эмбрионы утилизировать глюкозу уже со стадии 8-ми бластомеров, но основным субстратом она становится на стадии 16-ти бластомеров). Почему? Потому что нужно много ферментов, а они могут образовываться только после включения собственного генома эмбриона. И после этого включения появляется способность к утилизации глюкозы.