Гормональная стимуляция овуляции. Суперовуляция.

Мы можем получать мышей спонтанно овулирующих, а можем проводить гормональную стимуляцию овуляции. Гормональная стимуляция овуляции – это когда мы инъецируем половозрелых животных.

Еще есть понятие суперовуляция. Там есть особое требование – животные должны быть неполовозрелые (до первого эстрального цикла, но в весе 14-15 грамм). К сожалению то, что привозят из питомников не подходит для суперовуляции, потому что даже если мы закажем мышат по 14-14,5 грамм, то они будут скорее всего уже после первого эстрального цикла. Это из-за того, что мышей там кормят не очень хорошо, а для того чтобы мыши до половозрелости набрали нужный вес у них должен быть очень хороший рацион (много жиров, витаминов, белков). Так что мышей для суперовуляции можно откормить только самостоятельно.

При суперовуляции мы можем получить 20-50 ооцитов. При гормональной стимуляции мы получаем 12-15 (редко 20) ооцитов.

Как происходит стимуляция: вводим самкам сначала фолликулостимулирующий гормон в дозе 2,5-5 единиц активности. ФСГ иногда приходится увеличивать до 10 ед.акт. так как при хранении падает активность. Это можно понять по ответу мышей на гормон. Обычно доза подбирается в зависимости от линии, веса и второго препарата с которым работаем. Через 2-е суток колем хорионический гонадотропин в той же дозе, что и ФСГ. Овуляция после этого наступает примерно через 12 часов. Где брать гормоны? Купить. ФСГ дорогой и можно купить в ветеринарной аптеке, так как он используется для с/х животных. Или из клиник ЭКО. Они часто оттуда просроченные достают, так что увеличивают дозу. А ХГ очень дешевый и продается в аптеках свободно. Используется для сохранения беременности у женщин.

Двое суток (это про промежуток между гормонами) по разным протоколам - это период от 42 до 50 часов. Когда мы делаем гормональную стимуляцию, мы должны рассчитать так, чтобы овуляция произошла в середине темнового цикла.

Какие же должны быть мыши ,чтобы они хорошо отвечали на гормон? Это должны быть мыши, которые не подсаживались раньше в нестимулированных циклах. Мыши, содержащиеся в одной клетке, обычно синхронизируются по циклу. И они выходят из цикла в пролонгированный диэструс. Вот такие мыши идеально отвечают на гормон. А если вы их подсаживали до этого в нестимулированных циклах, то у них нормальный эстральный цикл и ответ хуже.

Получение датированной беременности у мышей. Особенности овуляции в естественном цикле.

Эмбрионы млекопитающих до имплантации доступные для работы – это в случае мыши от зиготы до бластоцисты. Зигота - сразу после оплодотворения, бластоциста находящаяся в зоне пеллюцида это 3,5 суток, бластоциста преимплантационная (вышла из з.п.) это 4,5 суток. (Обозначение Е10,5 и т.п. )

Мы часто получаем эмбрионы в нестимулированном цикле. У мышей овуляция происходит как правило в середине темновой фазы суток. Поэтому мы считаем 0,5 - это срок начала работы с зиготой. Т.е. это значит что с момента спаривания прошло 0,5 суток. День обнаружения вагинальной пробки иногда считают 0-м днем развития.

У мыши овуляция происходит не одномоментно и спаривается мышь обычно в начале эструса. Т.е. у нее начинается эструс, происходит овуляция, она спаривается и меньше чем через час (30 мин. примерно) формируется вагинальная пробка. И такая мышь в нормальном цикле может овулировать 7-10 яйцеклеток. И они по очереди оплодотворяются. Спермотозоид довольно быстро проходит ампулярную часть яйцевода и когда там оказываются яйцеклетки, то они по очереди оплодотворяются. Иногда разница по срокам развития ранних эмбрионов достигает нескольких часов (3-4 иногда). Если мы работаем с двухклеточными эмбрионами, даже с более поздними стадиями, то нам не особа важна такая разница в развитии. То есть нам из-за неоднородности группы нужно просто сделать ее побольше (для статистики). Но иногда нужно четко датировать стадии развития ранней зиготы (когда делаем что-то с пронуклеусами, например). Что мы тогда можем сделать? Можно прийти пораньше.

Обычно же мы получаем пробки, подсаживая мышей вечером (можно уже часов в 15-17), когда предыдущий эструс точно закончился. Но можно подсаживать мышей утром (утренние подсадки). Приходим часов в 8 и ссаживаем самок с самцами. У мышей овуляция произошла уже полностью и в ампулярной части яйцевода находятся неоплодотворенные ооциты. Мышь спаривается и все ооциты оплодотворяются одновременно, в течении 30 мин. И мы получаем четко одинаковые стадии развития.