Методи культивування вірусів, їх оцінка.

Приготування первинної культури клітин складається з декількох послідовних етапів: подрібнення тканини, роз'єднання клітин шляхом тріпсонізаціі, відмивання отриманої однорідної суспензії ізольованих клітин від трипсину з наступним суспензуванням клітин у живильному середовищі, що забезпечує їх зростання, наприклад в середовищі 199 з додаванням телячої сироватки крові.
Про розмноження (репродукції) вірусів в культурі клітин судять по цитопатичній дії (ЦПД), яке може бути виявлена мікроскопічно і характеризується морфологічними змінами клітин. Характер ЦПД вірусів використовують як для їх виявлення (індикації), так і для орієнтовної ідентифікації, тобто визначення їх видової приналежності.
Один з методів індикації вірусів заснований на здатності поверхні клітин, в яких вони репродукуються, адсорбувати еритроцити - реакція гемадсорбції. Для її постановки в культуру клітин, заражених вірусами, додають суспензію еритроцитів і після деякого часу контакту клітини промивають ізотонічним розчином хлориду натрію. На поверхні уражених вірусами клітин залишаються прилип еритроцити.
Інший метод - реакція гемаглютинації (РГ). Застосовується для виявлення вірусів у культуральній рідини культури клітин або хоріоналлантоісній або амніотичній рідині курячого ембріона.
Кількість вірусних частинок визначають методом титрування за ЦПД в культурі клітин. Для цього клітини культури заражають десятикратним розведенням вірусу. Після 6-7-денної інкубації їх дивляться на наявність ЦПД. За титр вірусу приймають найбільше розведення, яке викликає ЦПД в 50% заражених культур. Титр вірусу висловлюють кількістю цитопатичних доз.
Більш точним кількісним методом обліку окремих вірусних частинок є метод бляшок.
Деякі віруси можна виявити та ідентифікувати за включеннями, які вони утворюють в ядрі чи цитоплазмі заражених клітин.
Лабораторні тварини. Видова чутливість тварин до певного вірусу і їх вік визначають репродуктивну здатність вірусів. У багатьох випадках тільки новонароджені тварини чутливі до того чи іншого вірусу (наприклад, миші-сосунки - до вірусів Коксакі). Перевага даного методу перед іншими полягає в можливості виділення тих вірусів, які погано репродукуються в культурі або ембріоні. До його недоліків відносяться контамінація організму піддослідних тварин сторонніми вірусами та мікоплазмами, а також необхідність подальшого зараження культури клітин для отримання чистої лінії даного вірусу, що подовжує терміни дослідження.

Серологічні реакції, які використовують у вірусології. Реакція віруснейтралізації, механізм, принципи використання, діагностична цінність.

Основними реакціями серологічної діагностики які використовують в вірусології є: реакція звязування косплементу, непрямої і прямої гемаглютинації, імуноферментного аналізу, радіоімунного аналізу і імуноелектрофорез.

Реакція віруснейтралізації заснована на здатності специфічних віруснейтралізуючих антитіл блокувати цитопатичні, інфекційні, гемадсорбуючі або гемаглютинуючі властивості вірусів. Використовується для ідентифікації вірусів або діагностики вірусних інфекцій. Принцип: використовують суміш вірусів і діагностичну сироватку, додають завись еритроцитів і фіз. розчин. При наявності вірусів будуть характерні зміни ( гемаглютинація), а при нейтралізації вірусів сироваткою змін не буде. Позитивна реакці - гомогенне почервоніння, негативна - випадання осаду (гемаглютинація).

Реакція вірусної гемаглютинації та гемадсорбції. Механізм, практичне значення, використання, діагностична цінність.

Реакція гемаглютинації – феномен склеювання еритроцитів під впливом вірусів. Позитивна реакції – осад у вигляді «парасольки», негативна – у вигляді «гудзика».

РГадсорбціі – складні віруси при виході з клітини змінюють її мембрану, відбувається від брунькування. До цих змінених місць можуть прикріплятися еритроцити.

Реакція гальмування гемаглютинації, її механізм, умови постановки, принципи використання, діагностична цінність.

Реакція гальмування гемаглютинації (РГГА) - гемадсорбції. Реакція базується на здатності блокувати гемаглютинуючі властивості вірусів за допомогою специфічних антитіл. У результаті цього спостерігається затримка аглютинації еритроцитів. Компонентами реакції є невідомі антигени (вірусмісткий матеріал), який може бути збагачений пасажами в культурі клітин, лабораторних тваринах або курячому ембріоні, специфічні імунні противірусні (або проти окремих вірусних антигенів) сироватки, еритроцити. Для розведення компонентів реакції використовують забуферений фізіологічний розчин. Реакцію ставлять у пробірках або спеціальних полістиролових планшетах з луночками. Постановці реакції передує визначення активності вірусного антигена, який титрують за допомогою РГА. У досліді використовують робочу дозу антигена, яка дорівнює від 4 до 8 ГАО (ГАО – гемаглютинуюча одиниця – максимальне розведення антигена, яке повністю аглютинує стандартну суспензію еритроцитів). Позитивною реакцією вважають утворення червоного зернистого з нерівними краями осаду, який дифузно розташовується на дні пробірки. Про негативний результат свідчить наявність компактного осаду у вигляді ―ґудзика‖ на дні пробірки або лунки, який може стікати при її нахиленні. При частковій аглютинації утворюється осад у вигляді кільця.

Реакція зв’язування комплементу, її суть, оцінка. Особливості постановки реакції зв’язування комплементу при вірусних інфекціях.

Реакцію зв’язування комплементу належить до непрямих двосистемних гетерологічних реакцій і ґрунтується на принципі взаємодії комплементу із специфічним комплексом антиген- антитіло. Внаслідок цього не відбувається гемолізу сенсибілізованих еритроцитів. Компонентами реакції є вірусмісткий матеріал, специфічна імунна сироватка, комплемент, гемолітична сироватка, еритроцити барана та електроліт. Зважаючи на високу чутливість реакції, всі її компоненти перед постановкою основного досліду обов’язково титрують для визначення робочих доз інгредієнтів.

При виконанні реакції в окремих пробірках змішують вірусмісткий матеріал, специфічну імунну сироватку і комплемент у робочій дозі. Після інкубування цієї першої системи до неї додають попередньо сенсибілізовані гемолітичною сироваткою еритроцити барана.. При утворенні специфічного комплексу між вірусами та імунною сироваткою він набуває здатності адсорбувати комплемент. Тому наступне додавання гемолітичної системи не супроводжується лізисом еритроцитів – позитивний результат. Якщо антигени та антитіла є гетерологічними, вільний комплемент зв’язується із сенсибілізованими еритроцитами барана, викликаючи їх гемоліз. Залежно від ступеня вираження гемолізу реакцію оцінюють за 4-плюсовою системою: від ―++++‖ – різко позитивна реакція (прозора рідина і осад еритроцитів) до ―–― – негативна реакція (відсутність осаду еритроцитів, повний гемоліз або―лакова кров‖).