ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ И ТРАНСФЕРАЗЫ

Глава 6

ПРИМЕНЕНИЕ ГИДРОЛИЗАТОВ В ТЕХНОЛОГИИ ХЛЕБА

Расширяющееся производство ферментных препаратов из микромицетов, обусловленное успехами микробиологии, биохимии и химической технологии, приобретает все более важную роль в развитии биотехнологии. Большинство промышленно важных ферментов внеклеточные, извлечение и очистка их проще, чем цитоплазматических аналогов. Кроме того, получить высокий выход внеклеточных ферментов легче, так как он не ограничен доступной биомассой. Главной особенностью внеклеточного фермента является возможность перехода его через мембрану. Диффундируя через клеточную стенку, он накапливается в окружающей среде. В качестве продуцентов наиболее важных промышленных ферментов используют мицелиальные грибы родов Aspergillus, Rhizopus, Penicillium, а также некоторые дрожжи.

В технологии хлеба ферментные препараты используют для корректировки хлебопекарных свойств муки в нужном направлении, регулирования метаболизма дрожжевых клеток и молочнокислых бактерий, достижения желаемых реологических свойств полуфабрикатов, получения изделий с улучшенными свойствами и замедления процесса их черствения.

КАТАЛИТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ МИКРОБНЫХ ФЕРМЕНТОВ

Ферменты — это органические или биологические катализаторы, которые облегчают или ускоряют течение реакции, но при этом сами остаются без изменений. В зависимости от типа катализируемой реакции ферменты подразделяют на группы и подгруппы.

Все известные ферменты делятся на 6 классов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы, или синтетазы. Для биотехнологии хлебобулочных изделий наибольший интерес представляют первые три класса.

ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ И ТРАНСФЕРАЗЫ

К этому классу относятся ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции, связанные с процессами дыхания и брожения: дегидрогеназы, оксидазы, пероксидазы и др.

Дегидрогеназы.Схема действия никотинамидных дегидрогеназ (процесс дегидрирования — отщепление молекулы водорода):

Коферментами, переносящими из субстрата водород, являются никотинамидадениндинуклеотид (НАД) и никотинамидаде-ниндинуклеотидфосфат (НАДФ).

Схема действия флавиннуклеотидных дегидрогеназ

Оксидазы.Катализируют окислительно-восстановительные реакции с переносом водорода или электронов от окисляемого вещества непосредственно на молекулярный кислород; входят в класс оксидоредуктаз. Катализируя окисление фенольных веществ, эти ферменты улучшают цвет и придают стабильность продукту. Каталаза гидролизует пероксид водорода

и катализирует окисление метанола, этанола, муравьиной кислоты, фенолов с потреблением Н₂О₂.

К оксидазам относятся оксигеназы, осуществляющие окисление субстрата непосредственным присоединением к нему моле­кулярного кислорода. К их числу относится липоксигеназа, катализирующая образование пероксидов ненасыщенных жирных кислот путем присоединения О₂ по двойной связи.

Пероксидазы.Ферменты действуют на Н₂О₂ или органические перекиси, гидролизуя их, при этом донором выступают фенол, ароматический амин или ароматическая кислота; пероксид водорода играет роль акцептора.

Полифенолоксидазы — ферменты со смешанными функциями, у которых продукт окисления — дифенол одновременно играет роль донора водорода. Определенная часть полифенолоксидаз окисляет дифенолы.

Трансферазы.Кэтому классу относятся биокатализаторы, пе­реносящие ту или иную группу, например метальную или гликозильную, от одного соединения (донор) к другому (акцептор):

где Д — донор; R — переносимый радикал; А — акцептор.

Трансферазы включают гликозилтрансферазы и фосфотранс-феразы. К первым относятся ферменты, катализирующие синтез полисахаридов — крахмала, гликогена, декстрана, левана, сахарозы; ко вторым — ферменты, катализирующие перенос богатых энергией макроэнергетических фосфатных остатков.

ГИДРОЛАЗЫ

Гидролазы — наиболее обширная группа ферментов, входящих в состав ферментных препаратов, выпускаемых микробиологической промышленностью и применяемых в пищевой промышленности.

Эстеразы.Гидролизуют сложные эфиры карбоновых и тиокарбоновых кислот, моноэфиры фосфорной кислоты и др., катализируя разрыв эфирных связей. К этому подклассу относятся, в частности, ферменты, играющие важную роль в метаболизме липидов, нуклеиновых кислот и нуклеозидов, например ацетилхолинэстераза, дезоксирибонуклеазы, липазы, фосфатазы, фосфолипазы и эндодезоксирибонуклеазы. Наиболее широко применяется фермент пектинэстераза, содержащийся в ферментных препаратах пектаваморин П10х, пектофоетидин П10х и ксилоглюканофоетидин П10х.

Фосфатазы. Гидролизуют сложные эфиры фосфорной кислоты. Они отличаются по химической природе гидролизуемых ими субстратов. К ним относятся: монофосфатазы (фосфомоноэстеразы), гидролизующие моноэфиры фосфорной кислоты: глицерофосфат, глюкозо-1-фосфат, глюкозо-6-фосфат; дифосфатазы, гидролизущие диэфиры фосфорной кислоты, например диглицерин, фосфорный эфир; фитаза.

Фермент фитаза отщепляет фосфорную кислоту от инозит-фосфорной кислоты. Последняя в виде Са—Mg-соли представляет собой фитин. Весьма активная фитаза содержится в дрожжах и семенах многих растений. Оптимум действия фитазы пшеничного зерна находится при рН 5,8. Фитаза играет большую роль в качестве фактора пищевой ценности хлеба и в биотехнологических процессах.

Образующийся инозит способствует росту дрожжевых клеток, а фосфорная кислота участвует при брожении. Некоторые фосфаты содержатся в ферментном препарате амилоризин П10х.

Инозитфосфорная кислота, образуя нерастворимые соли с кальцием, препятствует его усвоению организмом человека. Фитаза дрожжей и муки в процессе брожения теста расщепляет большую часть содержащейся в нем инозитфосфорной кислоты, тем самым способствуя лучшему усвоению солей кальция.

К фосфатазам относятся также дезоксирибонуклеазы и нуклеотидазы, катализирующие гидролиз дезоксирибонуклеиновых кислот.

Нуклеотидазы — это монофосфатазы, отщепляющие остаток фосфорной кислоты от нуклеотида:

В культуре образуются фосфорная кислота и нуклеозид. Последний гидролизуется ферментом нуклеозидазой, принадлежащей к классу трансфераз.

Нуклеотидазы, дезоксирибонуклеазы и рибонуклеазы обнаружены в листьях и прорастающих семенах различных растений и различаются рядом свойств, в том числе своим отношением к рН.

Гликозидазы. Вподгруппу истинных гликозидаз входят ферменты, катализирующие гидролиз и синтез гликозидов. Действие гликозидаз зависит от наличия в гликозидазе а- или β-гликозидной связи.

Олигаза (a-гликозидаза) — фермент, расщепляющий a-гликозидную связь в дисахаридах и гликозидах. Содержится в тканях растений, плесневых грибах, дрожжах и бактериях. Особенно большое количество ее образуется в проросшем просяном солоде. Оптимум рН 7,0.

β-Гликозидаза — фермент, расщепляющий β-гликозидную связь в дисахаридах (целлобиозе и гентибиозе), полисахаридах и β-гликозидах (амигдалине, арбутине и др.). Фермент ингибируется аскорбиновой кислотой и активируется восстановленным трипептидом глутатионом (g-глутамилцистеинилглицином). Фермент β-гликозидаза содержится в ферментных препаратах: ксилоглюканофоетидине П10х, целлонигрине П10х, целлокандине Г10х, ксилонигрине П10х, ксилоаваморине Г10х, пектаваморине П10х, пектофоетидине П10х и цитороземине П10х.

a-Галактозидаза — специфический фермент, катализирующий гидролиз a-галактозидов — раффинозы с образованием a-галактопиранозы и сахарозы, а также мелибиозы. Содержится в пивных дрожжах и ферментном препарате, полученном из Aspergillus oryzae.

β-Галактозидаза катализирует гидролитическое расщепление лактозы на глюкозу и галактозу. Содержится в плодах миндаля, лактозных дрожжах, вызывающих брожение при получении продуктов из молока, бактериях и плесневых грибах, в молочной железе животных, в ферментных препаратах, например лактоканесцине Г10х и др.

β-Фруктофуранозидаза катализирует гидролиз сахарозы на глюкозу и фруктозу, раффинозу — на фруктозу и дисахарид мелибиозу, действуя на связь у β-гликозидного углеродного атома остатка фруктозы (a-гликозидаза гидролизует сахарозу у a-гликозидного углеродного атома остатка глюкозы):

β-Фруктофуранозидаза содержится в дрожжах, в том числе в пивных и ферментных препаратах, продуцентом которых является микромицет Aspergillus awamori.

Полиазы. В эту группу входят a- и β-амилазы, глюкоамилаза, целлюлаза, инулиназа (инулаза), гемицеллюлазы, протопектиназа и полигалактуроназа.

a-Амилаза гидролизует крахмал до декстринов различной молекулярной массы. При гидролизе крахмала до низкомолекулярных декстринов окраска с йодом крахмального клейстера не изменяется (ахроматическая точка). Содержится в слюне, пищеварительном соке, плесневых грибах, в проросших зернах пшеницы, ржи, ячменя, непроросших семенах сорго, в ферментных препаратах: амилосубтилине Г10х, Г20х, амилоризине П10х и других препаратах, полученных из плесневых грибов, особенно Aspergillus oryzae.

β-Амилаза катализирует гидролиз крахмала до мальтозы. Содержится в зерновых культурах; в соевых бобах, как проросших, так и непроросших.

Отдельно ни a-, ни β-амилаза не гидролизуют крахмал до мальтозы на 100 %. Только при их совместном действии достигается степень гидролиза 95 %.

Эти ферменты отличаются по своему отношению к рН (оптимум рН для a-амилазы ржи 5,5; для β-амилазы 4,4) и температуре (температурный оптимум для a-амилазы пшеницы 67 °С; для β-амилазы 51 °С).

От наличия и активности a- и β-амилаз зависит качество хле­бобулочных изделий — пористость, физические свойства мякиша, цвет корки, аромат и вкус. Энергичное действие a-амилазы вызывает избыточное накопление в тесте декстринов, что приводит к ухудшению показателей качества.

Глюкоамилаза отщепляет одиночные остатки глюкозы от нередуцирующего конца цепей крахмала, гликогена и некоторых других продуктов их гидролиза с образованием глюкозы и небольшого количества декстринов. Содержится в препаратах глюкаваморин П10х, глюкаваморин Г20х, глюкоделемарин П10х, глюкобататин П10х и в небольших дозах — в амилоризине П10х. С ее помощью получают глюкозную патоку и кристаллическую глюкозу. Для получения глюкоамилазы широко используются плесневые грибы: Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Rhizopus delemar и др.

Целлюлаза гидролизует клетчатку с образованием целлобиозы. Содержится в проросшем зерне, в некоторых бактериях и плесневых грибах.

Инулиназа найдена в высших растениях, накапливающих большое количество инулина, а также в плесневых грибах. Под действием инулиназы (инулазы) инулин гидролизуется с образованием фруктозы.

Гемицеллюлазы — ферменты, катализирующие гидролиз гемицеллюлоз. Содержатся в проросших семенах и плесневых грибах.

Протопектиназа и полигалактуроназа. Пектиновые вещества расщепляют под действием ряда ферментов:

На гликозидные связи действуют экзо- и эндополигалактуроназы, гидролизующие a-1,1-D-галактуронидные связи в пектине, пектовой и пектиновой кислотах и других полигалактуронидах.

Ферментные препараты, содержащие ферменты, гидролизующие пектиновые вещества, получают обычно из различных плесневых грибов. Эти ферменты содержатся в таких отечественных ферментных препаратах, как пектаваморин П10х, пектофоетидин П10х, пектоклостридин Г10х, мацеробациллин Г10х, ксилоглюканофоетидин П10х, а также в ячменном солоде.

a-Глюканаза гидролизует a-гликозидную связь в дисахаридах и гликозидах. При действии на мальтозу образуются две молекулы глюкозы. Содержится в препарате глюкаваморин П10х и в солоде.

β-Глюканаза гидролизует β-1,4-глюкановые связи в целлюлозе и β-глюкане. Содержится в амилосубтилине Г10х, ксило-глюканофоетидине П10х, цитороземине П10х, пектофоетидине П10х, пектаваморине П10х, целлоконингине П10х, целловередине Г10х.

Ксиланаза гидролизует β-1,4- и β-1,3-ксилановые связи. Фермент содержится в следующих препаратах: ксиланоглюкано-фоетидине П10х, ксилонигрине Г10х, пектаваморине П10х, пектофоетидине П10х, пектоклостридине Г10х.

Целлобиогидролазы катализируют гидролиз целлюлозы, отщепляя с невосстанавливающих концов ангидроглюкозных цепей β-1,4-глюканов целлобиозу. Содержатся в препаратах целлокандине Г10х и целловеридине Г10х.

Протеазы (пептидгидролазы). Катализируют гидролитическое расщепление белков и полипептидов в соответствии с уравнением

т. е. катализируют разрыв пептидной связи —CO-NH-, отщепляя одну или две аминокислоты с С- или N-конца полипептидной цепи (аминопептидазы, карбоксипептидазы), а также эндопептидазы или протеиназы, расщепляющие цепь вдали от концевых остатков.

Пептидазы.Различают эндо- и экзопептидазы. Ферменты первой группы, по Бергману, эндопептидазы действуют на центральные участки пептидной цепи, расщепляя молекулу белка на более мелкие фрагменты. Экзопептидазы не гидролизуют пептидные связи, находящиеся в середине цепи, а действуют либо с аминного конца цепи, либо карбоксильного, отщепляя последовательно одну за другой концевые аминокислоты.

Эндо- и экзопептидазы, расщепляя белок, действуют сообща: первые образуют большое число свободных концов, а вторые воздействуют на образовавшиеся фрагменты.

Протеиназы.Ферменты этой группы (пепсин, трипсин, химотрипсин, папаин) гидролизуют пептидные связи не только в белках, но и в различных полипептидах и дипептидах, при этом из белка образуются пептоны, полипептиды и свободные аминокислоты. Протеиназы способны вызывать створаживание молока.

Белки отдельных сортов пшеницы, резко различающихся по своим физическим свойствам клейковины, гидролизуются папаином с различной скоростью; точно так же различна скорость расщепления глобулинов, содержащихся в семенах различных видов бобовых растений. Этот факт обусловлен наличием в белке сульфгидрильных, аминных и оксигрупп.

Атакуемость белка зависит как от наличия в его молекуле оп­ределенных химических группировок, так и от форм белковой глобулы, ее конформации.

Эндопептидазы содержатся в ряде отечественных препаратов, таких, как протосубтилин Г10х (щелочная протеаза), амилосубтилин Г10х; экзопептидазы — амилоризин П10х, пектаваморин П10х, пектофоетидин П10х, ксилоглюканофоетидин П10х.

В целях стандартизации выпускаемых ферментных препаратов приняты товарные единицы их условной активности: амилоризин П10х —200 ед. АС/г; амилосубтилин Г10х — 3000 ед. АС/г; глюконигрин Г20х — 1000 ед. ГлС/г; пектаваморин П10х — 36 ед. ПкС/г (первый сорт); 27 ед. ПкС/г (второй сорт); 18 и 9 ед. ПкС/г — соответственно третий и четвертый сорта; пектофоетидин П10х— 36; 27; 18 и 9ед. ПкС/г соответственно для первого, вто­рого, третьего и четвертого сортов; протосубтилин Г20х (нейтральная протеаза) — 70 ед. ПС/г; протосубтилин Г20х — 100 000 ед. ПС/г (пептидаза щелочная гранулированная); протосубтилин Г10х— 50 000ед. ПС/г; пептидаза нейтральная; протосубтилин Г10х— 230; 180; 90 и 70 ед. ПС/г соответственно для первого, второго, третьего и четвертого сортов.