Работа № 4. Количественное определение содержания лецитина в сыворотке крови.

Принцип метода. Лецитин извлекается из сыворотки крови горячим спиртом; после минерализации в экстракте колориметрическим методом определяется неорганический фосфор, содержащийся в составе лецитинов. Количество лецитина определяется по стандартной кривой.

Ход работы. В пробирку налить 1 мл сыворотки крови и 2,5 мл спирта. Содержимое пробирки перемешать стеклянной палочкой. Пробирку неплотно закрыть резиновой пробкой и поместить на 10 минут в водяную баню при температуре 80°С. Параллельно поставить контрольную пробу с 2,5 мл смеси Блюра. Содержимое обеих пробирок охладить, профильтровать через обезжиренный фильтр в сухие пробирки. Для полноты извлечения содержимое пробирки сполоснуть 1-1,5 мл смеси Блюра и вылить на фильтр.

Полученные фильтраты (опыт и контроль) осторожно выпарить, добавить в каждую пробирку по 5 капель концентрированной серной кислоты и сжечь на слабом пламени спиртовки до появления бурой окраски и тяжелых белых паров. Пробирки охладить на воздухе, добавить по 5-6 капель пергидроля и содержимое пробирок вновь сжечь до обесцвечивания жидкости. После охлаждения в каждую пробирку добавить по 2 мл бидистиллированной воды, нейтрализовать содержимое пробирок 6-7 каплями 33% раствора едкого натра, после чего добавить по 2,5 мл ацетатного буфера (рН - 4,0), 0,5 мл 2% раствора молибденовокислого аммония и 1 мл 1% раствора аскорбиновой кислоты. Содержимое пробирок тщательно перемешать и через 10 минут колориметрировать на ФЭКе с красным светофильтром (опыт против контроля). Содержание лецитина в сыворотке крови в г/л рассчитать по калибровочному графику.

Клинико-диагностическое значение определение содержания лецитина в сыворотке крови.Содержание лецитина в сыворотке крови здорового человека зависит от возраста, составляя в среднем 1,5-2,7 г/л. Изменение содержания лецитина в крови наблюдается при ряде заболеваний (атеросклероз, сахарный диабет, микседема и др.).

Эталоны ответов на тесты

Вид 1. 1.1. - в, 1.2. – г, 1.3. – б.

Вид 2. 2.1. 1-Б, 2-В, 3-Г, 4-А;

2.2. 1- Г, 2- А, 3- Б, 4- Д, 5- В;

2.3. 1- Г, 2- Б, 3- А, 4- В, 5- В.

Вид 3. 3.1.- 1,2,3; 3.2.- 8, 5, 4, 2, 7, 1, 9.

Вид 4. 4.1.- А (+, +, +); 4.2.- С (+, -, -).

Эталоны ответов на ситуационные задачи

Задача 1. Выделение холестерина в желчь должно сопровождаться пропорциональным выделением желчных кислот и фосфолипидов, удерживающих гидрофобные молекулы холестерина в растворенном в виде мицелл желчи состоянии. При уменьшении образования желчных кислот и увеличении количества в желчи холестерина, последний выпадает в осадок, который постепенно становится более твердым. Эстрогены активируют на уровне транскрипции ГМГ-КоА-редуктазу – регуляторный фермент синтеза холестерина в печени и репрессируют 7-a- гидроксилазу регуляторный фермент синтеза желчных кислот. Такое влияние эстрогенов объясняет, почему желчнокаменная болезнь у женщин встречается чаще, чем у мужчин. Кроме того, эстрогены активируют на уровне транскрипции синтез ЛПНП-рецепторов гепатоцитов, что приводит к уменьшению содержания ЛПНП и общего холестерина в крови и увеличению холестерина в печени, и объясняет то, что частота заболевания атеросклерозом у женщин ниже по сравнению с мужчинами.

Задача 2. Жировая инфильтрация печени развивается при нарушении баланса между скоростью синтеза жиров в печени и скоростью выведения их из печени в кровь в составе ЛПОНП. Особенно закономерно жировая инфильтрация печени возникает при хронической алкогольной и другой интоксикации, при декомпенсированном сахарном диабете, ожирении, белковой недостаточности, в том числе алиментарной, при отравлении различными токсическими соединениями (четырехлористый углерод, фосфор и др.), при дефиците липотропных веществ. Известны два основных типа жировой инфильтрации печени: 1) стимуляция липолиза в жировой ткани, в ЛПОНП и ХМ повышает концентрацию свободных жирных кислот (СЖК), в том числе синтез триацилглицеринов (ТАГ), только часть ТАГ секретируется в составе ЛПОНП, остальные накапливаются. 2) нарушение образования липопротеинов (ЛП) по разным причинам: а) ингибирование синтеза белковой части ЛП (например, хлороформом, тяжелыми металлами, четыреххлористым углеродом), б) блок образования ЛП из липидов и белков; в) нарушение синтеза фосфолипидов, которые являются важными компонентами ЛП. Синтез фосфолипидов может лимитироваться дефицитом ненасыщенных ЖК, холина или доноров метильных групп (метионин и др.), называемых липотропными веществами; в) нарушение собственно секреторного механизма. Для профилактики и лечения назначается диета с повышенным содержанием белков, ограничением жиров, особенно тугоплавких животного происхождения. Рекомендуется творог, белок которого казеин содержит много метионина – незаменимой аминокислоты, являющейся донором метильных групп, необходимых для синтеза фосфатидилхолина.

Занятие № 3. Зачетное занятие по модулю «Структура и обмен липидов».

Цель занятия. Закрепить знания студентов о структуре, функции, основных путях обмена липидов, их регуляции и важнейших нарушений липидного обмена.

Содержание занятия. На занятии студентам предстоит пройти тест-контроль усвоения учебного материала на компьютере; написание контрольной работы и собеседование с преподавателем по теме с учетом результатов тест-контроля.

Методические указания к самоподготовке

При изучении материала обратите внимание на знание не только химизма тех или иных метаболических путей, но и на понимание их сущности, биологического значения, энергетическую ценность этих превращений. При повторении лабораторных работ акцентируйте внимание на знания принципа метода, этапы работы, количественную характеристику и диагностическую ценность определения тех или иных соединений в клинической практике.

Контрольные вопросы

 1. Структура основных классов липидов: свободных жирных кислот, триацилглицеридов, холестерина и холестеридов, глицеролфосфатов, сфинголипидов. Биологическая роль липидов в организме.

 2. Переваривание нейтрального жира в желудочно-кишечном тракте. Ферменты расщепления и особенности их действия.

3. Структура и биологическая роль желчных и парных желчных кислот.

4. Качественное и количественное определение липазы панкреатического сока, диагностическое значение.

 5. Особенности всасывания и транспорта липидов в крови организма человека. Роль липопротеинлипазы и ее связь с гепарином.

 6. Мобилизация жира из жировых депо. Тканевые липазы. Гормоны, стимулирующие липолиз. Механизм стимуляции липолиза адреналином.

 7. Пути образования и распад глицерина в тканях. Энергетическая ценность окисления глицерина до СО₂ и воды. Представьте схему распада глицерина и охарактеризуйте этапы, приводящие к синтезу АТФ.

 8. Тканевое окисление жирных кислот. Этапы окисления. Перенос жирных кислот в митохондриях с помощью карнитина. Ферменты и химизм отдельных фаз окисления жирных кислот.

 9. Энергетическая эффективность одного оборота b-окисления. Формула для расчета энергетической эффективности окисления жирных кислот.

 10. Пути использования ацетил-КоА в тканях.

 11. Кетоновые тела. Образование кетоновых тел из ацетил-КоА. Биологическое значение кетоновых тел.

 12. Кетонемия, кетонурия и возможные причины из возникновения. Качественная реакция на обнаружение ацетона в моче.

 13. Биосинтез жирных кислот. Синтетаза жирных кислот. Условия синтеза жирных кислот. Механизм переноса ацетил- КоА из митохондрий в цитоплазму.

 14. Ферменты и химизм отдельных этапов синтеза жирных кислот.

 15. Особенности синтеза непредельных жирных кислот. Витамин F.

 16. Синтез нейтрального жира в тканях. Роль глюкозы в синтезе жира в жировой ткани. Определение триглицеридов в сыворотке крови. Принцип метода, диагностическое значение.

 17. Липолитические и липогенетические гормоны. Влияние на тканевый обмен триглицеридов инсулина, тироксина, половых гормонов, адреналина, норадреналина, простагландинов.

18. Тканевый распад фосфолипидов. Ферменты расщепления фосфоглицеридов.

 19. Синтез фосфолипидов. Синтез фосфоглицеридов путем активации азотистых оснований и через стадию фосфатидной кислоты. Роль ЦТФ.

 20. Количественное определение лецитина в сыворотке крови. Принцип метода, диагностическая ценность.

 21. Переваривание холестеридов и всасывание холестерина. Понятие об экзогенном и эндогенном холестерине.

 22. Основные этапы синтеза холестерина. Химизм реакции образования мевалоновой кислоты. Ключевой фермент синтеза холестерина. Представьте схематически скваленовый путь синтеза холестерина.

 23. Биологическая роль холестерина. Пути использования холестерина в различных тканях. Биосинтез желчных кислот.

 24. Особенности обмена холестерина в организме человека. Роль липопротеинлипазы, печеночной липазы, липопротеинов, ЛХАТ, апопротеинов в транспорте холестерина в крови: a- и b -холестерин, коэффициент атерогенности, АХАТ, накопление холестерина в тканях. Пути распада и выведения холестерина.

 25. Содержание холестерина в сыворотке крови. Принцип метода определения и диагностическая ценность определения холестерина по Ильку.

 26. Роль холестерина в патогенезе атеросклероза, желчнокаменной болезни.

 27. Влияние на обмен липидов адреналина, норадреналина, половых гормонов, иодированных гормонов щитовидной железы, инсулина, лактикотропина.

Примеры тест-контроля

1. Ферменты, участвующие в переваривании липидов:

1) панкреатическая липаза

2) желудочная липаза у грудных детей

3) фосфолипаза

4) холестеролэстераза

5) липопротеинлипаза

2. Основные переносчики экзогенных пищевых жиров из кишечника в ткани:

1) Хиломикроны

2) ЛПОНП

3) ЛПНП

4) ЛППП

5) ЛПВП

3. Липопротеинлипазу активируют:

1) АпоА-I

2) АпоВ-100

3) АпоС-I

4) АпоС-II

5) АпоЕ

4. Превращение ГМГ-КоА в мевалонат:

1) Зависит от количества холестерола, поступившего с пищей

2) Является регуляторной реакцией в синтезе холестерола

3) Происходит с участием НАДФН

4) Происходит в цитозоле клеток

5) Замедляется при увеличении индекса инсулин/глюкагон

5. Причины гиперхолестеролемии:

1) увеличение активности ЛХАТ

2) снижение активности ЛХАТ

3) питание высокой энергетической ценности

4) питание низкой энергетической ценности

5) уменьшение числа рецепторов ЛПНП

6. Причиной семейной гиперхолестеролемии является:

1) неправильное питание в семье

2) поступление избытка холестерина с пищей

3) мутации в гене апоС-I

4) мутации в гене липопротеинлипазы

5) мутации в гене белка-рецептора ЛПНП

7. Синтез жирных кислот увеличивается в результате:

1) фосфорилирования ацетил-КоА-карбоксилазы

2) дефосфорилирования ацетил-КоА-карбоксилазы

3) фосфорилирования синтазы жирных кислот

4) дефосфорилирования синтазы жирных кислот

5) ингибирования цитратлиазы

8. Кетоновые тела синтезируются в печени, но не используются ею как энергетические субстраты, потому что в гепатоцитах отсутствует….

1) ацетоацетил-КоА-тиолаза

2) β-гидроксибутиратдегидрогеназа

3) сукцинил-КоА-ацетоацетаттрансфераза

4) 3-кетоацил-КоА-трансфераза

9. Судьба холестерина в печени: … .

1) окисление с образованием желчных кислот

2) использование для построения мембран гепатоцитов

3) участие в формировании ЛПОНП

4) конъюгация

5) этерификация

Эталоны ответов на тесты

1.- 1,2,3,4; 2.- 1; 3.- 4; 4.- 1,2,3,4; 5.- 2,3,5; 6 - 5; 7.- 2; 8.- 3; 9.- 1,2,3,5.