Работа № 2. Определение содержания общего холестерина в сыворотке и плазме крови ферментативным колориметрическим методом. 

Принцип метода.Определение основано на ферментативном (с участием холестеролэстеразы - ХЭ) гидролизе эфиросвязанной фракции холестерина и окислении всего содержащегося в исследуемой биологической жидкости свободного холестерина под влиянием холестеролоксидазы (ХО). Реакция сопровождается высвобождением пероксида водорода, вызывающего катализируемое пероксидазой (ПО) превращение 4-аминоантипирина (4-ААП) и фенола в окрашенное соединение (хинонимин) розово-малиного цвета с максимумом поглощения при 500 нм. Интенсивность окраски образовавшегося продукта пропорциональна концентрации холестерина.

Эфиры холестерина + Н₂О → холестерин + жирные кислоты,

                                                                    ^ХЭ

Холестерин + О₂ → холестенон + Н₂О₂,

                        ^ХО

2 Н₂О₂ + 4-ААП + фенол → хинонимин +4 Н₂О.

                                                              ^ПО

Ход работы.Приготовить опытные пробы (0,02 мл сыворотки крови и 2 мл рабочего реагента), холостую пробу (0,02 мл дистиллированной воды и 2 мл рабочего реагента) и пробу с калибратором (0,02 мл калибратора и 2 мл рабочего реагента). Рабочий реагент обязательно вносить в пробирки после проб, содержащих холестерин. Пробирки встряхнуть и инкубировать при температуре 37°С. Через 10 минут после начала инкубации пробирки повторно встряхнуть и инкубировать еще 20 минут при температуре 37°С. Окрашенные пробы фотометрировать при 500 нм в кювете с длиной оптического пути 5 мм относительно холостой пробы. Окраска стабильна в течении двух часов при комнатной температуре. Концентрацию холестерина в исследуемых пробах рассчитать по формуле:

С = (Е_оп/Е_к) × 5 ммоль/л.

где: Е_оп и Е_к – оптическая плотность исследуемой пробы и пробы с калибратором, соответственно. При результате выше 13 ммоль/л пробы следует развести в два раза дистиллированной водой, повторить анализ и полученный результат умножить на 2.

Ход работы.Приготовить пробы:

Реакционные смеси перемешать и инкубировать в течение 20 минут при температуре 37°С. Измерить оптическую плотность опытной и калибровочной проб против холостой пробы при длине волны 500 нм в кюветах с шириной слоя 5 мм. Окраска раствора стабильна в течение 2 часов при предохранении от прямого солнечного света.

Расчет.Содержание холестерина в сыворотке крови (С) в ммоль/л определяют по формуле:

С  = 5,17 × Е_оп/Е_к,

где: Е_оп и Е_к – оптическая плотность исследуемой пробы и пробы с калибратором, соответственно;

5,17 – концентрация холестерина в калибраторе, ммоль/л.

При результате выше 13 ммоль/л пробы следует развести в два раза дистиллированной водой, повторить анализ и полученный результат умножить на 2.

Интерпретация результатов анализа:

Уровень холестерина в крови (показатели концентрации холестерина в сыворотке крови):

нормальный (желаемый) - < 5,2 ммоль/л,

погранично-высокий – 5,2 - 6,2 ммоль/л,

высокий - > 6,2 или 6,7 ммоль/л соответственно для мужчин и женщин старше 20 лет;

умеренная гиперхолестеринемия – 6,2-7,5 или 6,5-7,8 ммоль/л;

тяжелая гиперхолестеринемия - > 7,5 или > 7,8 ммоль/л.

Работа № 3. Определение холестерина в ЛПВП, ЛПНП и ЛПОНП. Расчет атерогенности.

Принцип метода.Способ основан на определении концентрации общего холестерина в пробах сыворотки крови до осаждения атерогенных апо-В-содержащих липопротеинов (ЛПОНП, ЛПНП и их «ремнанты») и после такового α-холестерина (холестерина ЛПВП) в супернатанте с дополнительным расчетом холестеринового коэффициента (индекса) атерогенности.Содержащиеся в сыворотке кровиЛПОНП и ЛПНП образуют нерастворимые комплексы с фосфорновольфрамовой кислотой и ионами магния, полученная после осаждения преципитата надосадочная жидкость используется для определения холестерина ЛПВП (ЛПВП-ХС).

Ход работы. К 1,0 мл сыворотки крови прилить 0,1 мл MgCl₂ на 4% водном растворе фосфорновольфрамовой кислоты. Инкубировать в течение 30 мин при 4⁰С (в ледяной воде) с целью полного выпадения в осадок ЛПОНП и ЛПНП. Центрифугировать пробу в течение 15 мин при 3000 об/мин. В супернатанте определить содержание α-холестерина (ЛПВП-ХС). Для этого в сухую пробирку поместить 2,1 мл реактива Либермана-Бурхарда и осторожно по стенке пробирки добавить 0,1 мл супернатанта и далее проводить определение как описано в работе № 1.

По разнице содержания холестерина в цельной крови (общий ХС, см. работу №1) и в ЛПВП рассчитать уровень холестерина фракций ЛПОНП и ЛПНП.

 Расчет холестеринового коэффициентаатерогенности (К_хс) произвести по формуле:

К_хс = ^{Общий ХС – ЛПВП-ХС}

                    ^{ЛПВП-ХС}

Клинико-диагностическое значение.Оптимальный уровень ЛПВП-ХС (α-холестерина) 0,4-0,6 г/л. Определение уровня ЛПВП-ХС способствует выявлению риска развития ИБС. Снижение уровня ЛПВП-ХС на каждые 0,05 г/л ниже среднего ведет к увеличению риска развития ИБС на 25 %. Повышенный уровень ЛПВП-ХС расценивается как антиатерогенный фактор.

Следует учитывать, что изменение содержания ЛПВП-ХС может наблюдаться при ряде заболеваний и состояний. Так, повышение уровня ЛПВП-ХС отмечается при первичном билиарном циррозе печени, хроническом гепатите, алкоголизме, хронических интоксикациях. Снижение уровня ЛПВП-ХС наблюдается при сахарном диабете, заболеваниях почек и печени, гиперлипопротеинемии IV типа, острых бактериальных и вирусных инфекциях.

Для определения тактики лечения и профилактики возникновения ИБС важно совместно оценивать уровень в сывортке крови общего холестерина и ЛПВП-ХС. Индекс атерогенности К_хс, который в норме у здоровых лиц варьирует в пределах 2-4, более точно отражает благоприятное и неблагоприятное сочетание липопротеинов (ЛП) с точки зрения риска развития ИБС и атеросклероза, так как характеризует отношение атерогенных ЛП к содержанию антиатерогенных ЛП в сывортке крови. Этот коэффициент у новорожденных не более 1, достигает 2,5 у здоровых мужчин 20-30 лет и 2,2 – у здоровых женщин того же возраста; у мужчин 40-60 лет без клинических проявлений атеросклероза от3 до 3,5; у лиц с ИБС он больше 4, нередко достигая 5-6; у лиц старше 90 лет не превышает 3.