Области применения HLA-диагностики

1 Низкоразрешающее генотипирование при трансплантации солидных органов

2 Высокоразрешающее генотипирование при трансплантации костного мозга

3 Диагностика HLA-ассоциированных заболеваний

4 HLA-диагностика при невынашивании

5 Мониторинг предсуществующих HLA-антител

Методы, применяемые в мире сегодня для HLA-типирования

1 Серологические – микролимфоцитотоксический тест

2 Молекулярно-генетические:

- SSP (sequence specific primers);

- SBT (sequence-based typing);

- SSO (sequence specific oligonucleotides).

Серологическое HLA-типирование

В основе серологического HLA-типирования лежит микролимфоцитотоксический тест, с детекцией результатов методом фазово-контрастной или флуоресцентной микроскопии.

Первым этапом при проведении микролимфоцитотоксического теста является иммуномагнитное выделение Т- или В-лимфоцитов из цельной крови с использованием частиц Dynabeads. Технология биомагнитного сепарирования основана на применении Dynabeads – парамагнитных микрочастиц, покрытых полистиролом. Существует множество различных частиц – Dynabeads частицы с конъюгированными моноклональными антителами, поликлональными антителами или другими белками.

После выделения Т- и В-лимфоцитов проводится постановка микролимфоцитотоксического теста:

1 В лунки полистеролового планшета, содержащие гистотипирующие сыворотки, вносят по 1 мкл выделенных клеток (Т- и В-лимфоцитов).

2 Добавляют 3-5 мкл комплемент-содержащего окрашивающего раствора.

3 Добавляют трепановый синий. При наличии специфического лизиса краситель проникает внутрь клетки, в результате чего она приобретает синее окрашивание.

4 Считывают результат HLA-типирования при помощи фазово- контрастной или флуоресцентной микроскопии. Результат принимается за положительный при наличии в пробе 80% клеток, подвергшихся специфическому цитолизу.

Проба на индивидуальную совместимость

В основе пробы на индивидуальную совместимость лежит лимфоцитотоксический тест. Для этого к лимфоцитам донора добавляют сыворотку реципиента. Цель исследования – выявить любые антитела, которые могут реагировать с антигенами HLA донора и вызвать сверхострое отторжение трансплантата. Сверхострое отторжение обусловлено взаимодействием антител с антигенами HLA донора, находящимися на эндотелии трансплантата. Образовавшиеся комплексы активируют комплемент, который повреждает эндотелий и тромбоциты, приводя к тромбозу сосудов трансплантата.

Положительный лимфоцитотоксический тест свидетельствует о высоком риске не только сверхострого, но и острого и хронического отторжения трансплантата.

Острое отторжение обусловлено образованием антител, хроническое – появлением цитотоксических Т-лимфоцитов, направленных против антигенов донора.

Сыворотка реципиента для проведения пробы на индивидуальную совместимость должна быть получена не более чем за 1 месяц до исследования. Дополнительно можно исследовать более ранние пробы сыворотки реципиента – иногда это позволяет выявить антитела, которые присутствовали в сыворотке реципиента в низком титре, а к моменту последнего забора крови исчезли. В этом случае обычно исследуют пробу сыворотки, содержащей наибольшее количество антител к разным антигенам HLA. Единого мнения о целесообразности исследования сывороток, полученных более чем за 6 месяцев до проведения пробы, нет. Считается, что оно необходимо, если у реципиента ранее обнаружились антитела ко многим антигенам HLA или в прошлом он уже перенес трансплантацию. При этом обычно исследуется 2-6 проб сыворотки. Ложноположительные результаты лимфоцитотоксического теста возможны при наличии в сыворотке реципиента аутоантител, перекрестно-реагирующих с лимфоцитами донора. Присутствие аутоантител подтверждается при смешивании сыворотки реципиента с его собственными лимфоцитами. Аутоантитела не повышают риск отторжения трансплантата.

Для выявления в сыворотке реципиента антител к антигенам HLA донора дополнительно проводят следующие исследования:

- Сыворотку реципиента смешивают с суспензией лимфоцитов и моноцитов донора и добавляют комплемент. Для повышения чувствительности исследования увеличивают время инкубации. Поскольку в суспензии содержится около 70% Т-лимфоцитов и 30% В-лимфоцитов и моноцитов, положительный результат данного исследования свидетельствует о том, что в сыворотке реципиента присутствуют как антитела к антигенам HLA класса I , так и антитела к антигенам HLA класса II .

- Лимфоцитотоксический тест с Т-лимфоцитами позволяет выявить только антитела к антигенам HLA класса I. Поскольку выделить из крови Т-лимфоциты относительно просто, это исследование широко распространено. Если в сыворотке реципиента обнаруживаются IgG к Т-лимфоцитам, трансплантация от этого донора абсолютно противопоказана.

- Лимфоцитотоксический тест с В-лимфоцитами позволяет выявить антитела к антигенам HLA как класса I, так и класса II, поскольку В-лимфоциты несут на своей поверхности антигены обоих классов. Лимфоцитотоксический тест с В-лимфоцитами более информативен, чем с Т-лимфоцитами, поскольку на поверхности В-лимфоцитов больше антигенов класса I. Исследование часто проводится с разными разведениями сыворотки реципиента. Это позволяет определить титр антител к антигенам HLA донора. Если он превышает 1:4, то высок риск сверхострого отторжения трансплантата.

- Проточная цитофлюориметрия также позволяет определить титр антител к антигенам HLA донора. Метод заключается в следующем. Лимфоциты донора инкубируют с сывороткой реципиента, после чего к смеси добавляют меченные флуоресцентной меткой антитела к иммуноглобулинам человека. Присутствующие в сыворотке реципиента антитела связываются с лимфоцитами, а затем – с мечеными антителами. Результат исследования выражают в виде гистограммы. По оси абсцисс откладывают интенсивность флюоресценции, по оси ординат - число флюоресцирующих клеток.

Использование моноклональных антител к уникальным антигенам клеток, например CD3 Т-лимфоцитов или CD20 В-лимфоцитов, позволяет исследовать отдельные популяции клеток. Чтобы отличить эти антитела от антител к иммуноглобулинам человека, их метят разными флуоресцентными метками. Таким образом, Т-лимфоциты, несущие исследуемые антигены HLA класса I, одновременно испускают красное и зеленое свечение. Чувствительность проточной цитофлуориметрии примерно в 100 раз превышает чувствительность серологических методов. Однако высокая чувствительность приводит к тому, что помимо антител к антигенам HLA выявляется множество других антител сыворотки реципиента, реагирующих с лимфоцитами донора, например аутоантител. В связи с этим положительный результат проточной цитофлюориметрии при определении антител к антигенам HLA требует дополнительных исследований.

II Иммунитет к опухолям

Спонтанное или индуцированное усиление клеточной пролиферации приводит к возникновению опухолей, которые в большинстве случаев являются злокачественными для организма.

Клинические и экспериментальные наблюдения указывают на участие иммунных механизмов контроля за неопластическим ростом:

1) вероятность возникновения опухолей у иммунодефицитных детей в 10000 раз выше, чем у здоровых;

2) тимэктомия, или врожденное отсутствие тимуса, как, например, у мышей линии nudе, приводит к увеличению частоты спонтанных опухолей или к большей легкости канцерогенной индукции новообразований;

3) применение иммунодепрессивной терапии способствует возникновению неопластического роста;

4) наличие у опухолевых клеток специфических антигенов определяет развитие иммунного ответа главным образом Т-клеточного типа.

В ряде случаев опухолевые клетки приобретают способность подавлять иммунный ответ и тем самым «ускользать» из-под контроля со стороны иммунной системы.