СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О БИОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВАХ ДРОЖЖЕЙ

Глава 2

МЕТАБОЛИЗМ ДРОЖЖЕВЫХ КЛЕТОК И

МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ

Хлебопекарная промышленность базируется на использова­нии дрожжей и бактериальных заквасок. Микробиологическим процессам, протекающим под их действием в полуфабрикатах, присущи огромные потенциальные возможности, целенаправленное, контролируемое использование которых позволит значительно ускорить образование сложных органических веществ, обусловливающих созревание теста, вкус и аромат хлеба.

Применение дрожжей в промышленности всецело связано с их размножением, предопределяемым обменом веществ (метаболизмом). Ведущую роль в осуществлении биохимических реакций играют ферменты, выполняющие различные каталитические функции. Регулирование и координирование биохимических процессов зависят не только от количества ферментов, но и от их активности, определяемой внешними условиями. Они действуют на ферменты непосредственно и необратимо, снижая или повы­шая их активность.

СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О БИОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВАХ ДРОЖЖЕЙ

В производстве хлебобулочных изделий из пшеничной сортовой муки применяют в основном биомассу дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae, содержащих биологически активные вещества и обладающих ферментативной активностью. Они обеспечивают спиртовое брожение пшеничных и ржаных полуфабрикатов и их разрыхление в анаэробных условиях.

Органические молекулы дрожжевой клетки состоят из простых исходных молекул: кетокислот, пуриновых и пиримидиновых оснований, пентоз, гексоз, фосфопирувата, малата, ацетата и некоторых других. Эти соединения по строению и химическому составу отличаются от ингредиентов среды, в которой проявляется аэробная и анаэробная жизнедеятельность.

Источники углерода в клетке подвергаются многоступенчатому ферментативному расщеплению, при этом каждый из них индуцирует синтез «собственных» ферментов. Затем в клетке образуются биомолекулы (аминокислоты, мононуклеотиды, сахара, жирные кислоты, глицерин), т. е. ее строительные блоки. Из биомолекул синтезируются разнообразные органические и тонкоспецифические макромолекулы, придающие дрожжевой клетке уникальные свойства, характерные только для живого микроорганизма. Первой отличительной особенностью дрожжевой клетки является то, что структуры высшего порядка белков и нуклеиновых кислот в ней определяют ее метаболизм и жизнедеятельность.

Второй особенностью клетки, в состав которой входят биологически важные макромолекулы, является их сложная организация. Синтез этих соединений происходит по строго спланированным схемам, обеспечивающим их специфичность. Образование новых молекул и синтез макромолекул рассматриваются в настоящее время как использование генетической информации, записанной в виде последовательности оснований ДНК в хромосомах материнской клетки. Молекула ДНК воспроизводит новую молекулу, не отличающуюся от исходной. Последовательность оснований ДНК обеспечивает последовательность аминокислот в молекуле белка. Сложная организация макромолекул, их строгое воспроизведение способствуют жизнедеятельности клетки.

Третья особенность живой клетки заключается в том, что все ее компоненты (белки, нуклеиновые кислоты, липиды, углеводы) непрерывно изменяются, постоянно обновляются, т. е. в клетке происходит непрерывный круговорот молекул.

К биологически активным веществам, участвующим в различных биохимических процессах дрожжевой клетки, относятся биокатализаторы — ферменты. Они обладают способностью активизировать, осуществлять и координировать биохимические превращения, проявляя строгую специфичность действия. Дрожжи легко приспосабливаются к изменениям в составе питательной смеси благодаря индуцированному образованию ферментов.

Согласованный биосинтез клеточных компонентов регулируется очень точными и целенаправленными механизмами регуляции ферментативных процессов. Изменение количества синтезируемых ферментов в клетке идет в результате индукции и репрессии. Индукцией называют процесс увеличения количества соответствующего фермента в клетке под влиянием субстрата. Последний индуцирует образование ферментов обмена веществ в процессах энергетического катаболизма.

Теория, разработанная Жакобом и Моно, дает понятие о механизме индукции ферментов. Синтез ферментов определяют цистроны — участки молекулы ДНК, или структурные гены. Кроме них в молекуле ДНК находятся регуляторные гены, контролирующие деятельность структурных генов и вызывающие или прекращающие синтез белковых веществ — репрессоров. Репрессией называют процесс уменьшения скорости биосинтеза какого-либо фермента или группы ферментов, катализирующих цепную реакцию определенного процесса при помощи специальных веществ — репрессоров. При наличии в окружающей среде индуктора фермента, например лактозы, являющейся индуктором β-галактозидазы, он инактивирует репрессор, структурный ген освобождается и происходит синтез β-галактозидазы (рис. 2.1). Такие ферменты называют индуцированными. Количество конститутивных ферментов в клетке постоянно.

Рис. 2.1. Схема регуляторного механизма процесса индукции:

а — без индуктора; б  — с индуктором

Следовательно, дрожжевые клетки и другие микроорганизмы обладают способностью производить перестройку внутриклеточной ферментной системы и метаболических путей при изменении состава среды и условий жизнедеятельности. Клетка может и не производить синтеза ферментов, необходимых для образования данного продукта, если она получает этот продукт в готовом виде из питательной смеси. Обменные процессы координируются и направляются посредством регуляции синтеза клеточных ферментов. Индуцированная ферментативная активность изменяется под влиянием состава питательной смеси при наличии или отсутствии специфического субстрата — индуктора. Характер метаболизма дрожжевой клетки в значительной степени предопределяется условиями метаболизма и типом жизнедеятельности.

Дрожжи и дрожжеподобные грибы относятся к двум большим группам: сумчатым и несовершенным грибам. Истинные дрожжи относятся к классу Ascomycetes, подклассу Endomycetales, который включает три семейства, различающиеся между собой способом вегетативного размножения. Каждое семейство разделяется на несколько родов в зависимости от формы спор, способа их обра­зования и прорастания. В основу видового различия положено отношение организма к сахарам.

Из этой группы дрожжей наиболее интересен род Saccharomyces, включающий 41 вид. Эти дрожжи подразделяются на подгруппы. К первой подгруппе относятся дрожжевые клетки, сбраживающие глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, на 1/3 раффинозу, но не сбраживающие лактозу: спиртовые Saccharomyces cerevisiae рас Я, В, Л, XII, XV и др.; пивоваренные — Saccharomyces cerevisiae Frobeg, Saccharomyces carlsbergensis рас 11, 776, A, 44, S (Львовская); винные — Saccharomyces vini (ellipsoideus); хлебопекарные — Saccharomyces cerevisiae рас 14 и др. Эти дрожжи усваивают этанол, глицерин, молочную, уксусную и другие кислоты. Дрожжевые клетки имеют круглую, яйцевидную или овальную форму шириной 5—7 мкм и длиной 8—11 мкм.

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae образуют богатый и разнообразный ферментный комплекс, особенно зимазный. Но они не индуцируют амилолитические и декстринолитические ферменты, фермент a-галактозидазу. Поэтому они не усваивают трисахариды и более сложные по строению олигосахариды. Они мало или вовсе не образуют внеклеточную протеиназу и пептидазу. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae слабо размножаются в условиях повышенного содержания спирта и не защищены антибиотическими свойствами против кислотообразующих бактерий. Поэтому вопросы, связанные с выявлением или получением наиболее ак­тивных и жизнеспособных дрожжей, весьма актуальны.

Кроме культурных дрожжей в среде дрожжерастительных аппаратов часто встречаются дикие дрожжи: Candida tenuis, Candida curvata, Candida humicola, Candida solanii, Torulopsis dattila, Candida guilliermondii и Candida utilis. Они бедны зимазным комплексом и слабо сбраживают сахар. Только дрожжи Candida robusta в количестве 10 % биомассы пекарных дрожжей повышают их стойкость при хранении.

СТРОЕНИЕ ДРОЖЖЕВОЙ КЛЕТКИ

Дрожжевые клетки являются достаточно сложными одноклеточными организмами. Дрожжевая клетка (рис. 2.2) состоит из клеточной стенки, цитоплазматической мембраны, протоплазмы, цитоплазмы и включений — ядра, митохондрий и рибосом, вакуолей и запасных веществ — волютина, гликогена и жировых капель. В дрожжевых мембранных структурах имеются аппарат Гольджи и лизосомы.

Дрожжевые клетки способны вовлекать простые ингредиенты системы в процесс метаболизма. Поступление веществ из внешней среды обеспечивают клеточная стенка дрожжевой клетки, цитоплазматическая мембрана, пиноцитоз и эндоплазматическая сеть. Клеточная стенка является основным структурным компонентом клетки. В ее состав входят белково-полисахаридные комплексы и липиды. Часть белков находится в виде ферментов. Липиды представлены жирными кислотами, фосфолипидами и стеролами. Липидные молекулы играют важную роль в транспорте водонерастворимых веществ.

Очень важными компонентами клеточной стенки, влияющими на ее проницаемость, являются тейхоевые кислоты — полимеры, образуемые рибофосфатами или глицерофосфатами. В отличие от цитоплазматической мембраны клеточная стенка проницаема для солей и других низкомолекулярных соединений.

Цитоплазматическая мембрана расположена непосредственно за клеточной стенкой. Она является главным определителем осмотического давления, транспорта веществ и их проницаемости и построена из бимолекулярного слоя липидов, в который вкраплены белковые молекулы или их комплексы.

Клеточная мембрана характеризуется полупроницаемостью, обеспечивая поступление веществ в клетку при снижении их концентрации в ней по сравнению с окружающей средой.

Элементарная мембрана схематически представлена на рис. 2.3.

Цитоплазматическая мембрана у дрожжей содержит примерно равное количество белка и липидов. Ее глобулярная структура приведена на рис. 2.4.

Как видно из рис. 2.4, белковые молекулы, расположенные между слоями липидов, могут изменять свое положение. Липиды согласно этой модели организованы в бислои, но они не являются непрерывными. Липид ведет себя как растворитель для неполярных участков белков, стероидов и т. д. Эта модель адекватно описывает состояние белков в мембране, чем и привлекательна.

Рис. 2.3. Модель элементарной мембраны Робертсона

В мембранах осуществляются важнейшие функции клетки. В них вмонтированы места инициации синтеза ДНК, цепи электронного транспорта, ферменты сопряжения окисления с фосфорилированием. Вблизи мембраны находятся ферменты окисле­ния жиров, трикарбоновых кислот и т. д. На наружной стороне мембран расположены ферменты гликолиза, протеолиза, эстеразы и др.

Рис. 2.4. Глобулярная структура биомембраны дрожжей:

1 — белок; 2 — белковый комплекс; 3  — двойной слой липидов (стрелки указывают на изменение положения белков)

Важное значение в жизнедеятельности дрожжевой клетки имеют гидрофобные вещества: неполярные аминокислоты, витамины, стероиды. Первая функция мембран — это создание гидрофобной зоны внутри и на границе клетки. В этом случае липиды выполняют роль гидрофобного растворителя.

Вторая функция мембран — это обеспечение построения мультиэнзимных комплексов, включающих систему ионов натрия и калия, активируемую АТФ, цепь ферментов окислительного фосфорилирования.

Третья функция мембран — осуществлять распознавание и связывание аминокислот и промежуточных продуктов обмена (медиаторов), например циклического АМФ (аденозин-3,5-цик-ломонофосфат).

Клеточная мембрана преобразует трансмембранную разность электрических потенциалов в химическую энергию, которая аккумулируется в макроэргических соединениях. Мембранные компоненты играют роль ионообменника, регулируя прохождение заряженных ионов через мембрану. Мембраны могут накапливать минеральные и органические ионы и посредством сорбции и ионного обмена удерживать их вблизи или на поверхности мембранных структур. Другие ионы, входящие в состав среды, мембраной будут исключаться.

Транспорт углеводов зависит от их строения, положения Н⁺-и ОН^–-групп, от степени асимметричности, от наличия веществ-антагонистов (проникновению глюкозы в клетку мешает галактоза, а проникновению галактозы — мальтоза и т. д.). Распределение веществ между клетками и окружающей средой характеризует коэффициент распределения, который при равновесии концентрации в клетках и среде равен 1. Коэффициент распределения аминокислот довольно высокий: от 200 до 900. Поступление аминокислот в клетку, связанное с потреблением энергии, обеспечивается пермеазами и зависит от наличия антагонистов (валин препятствует проникновению фенилаланина, аланин, лейцин, гистидин мешают переносу глицина).

Необходимо отметить еще одну функцию мембраны: слой воды в несколько микрометров, примыкающий к мембране, не перемешивается с остальным объемом раствора. Это позволяет создать совокупность тех или иных веществ вблизи мембраны и обеспечить дополнительное диффузионное препятствие для проникновения в клетку веществ.

Цитоплазма (протоплазма) — это внутриклеточное содержимое, состоящее в основном из коллоидов. Вязкость этой фазы зависит от физиологических факторов клетки. В цитоплазме содержатся структурные, а также не связанные с органоидами ферментные белки, аминокислоты, рибонуклеиновые кислоты, углеводы, минеральные соли, липиды, вода и низкомолекуляр­ные вещества. В ней располагаются все структурные единицы клетки и гранулы запасных веществ различной природы. Именно цитоплазма осуществляет непосредственную связь между орга­ноидами клетки. Например, первая стадия дыхания — гликолиз и спиртовое брожение — протекает в цитоплазме, а последующий этап — цикл трикарбоновых кислот — в митохондриях.

Эндоплазматический ретикулум расположен в цитоплазме дрожжевых клеток. Это система каналов, пузырьков или цистерн, связанная с цитоплазматической мембраной и ядерной стенкой — нуклеолеммой. Толщина ретикулярных мембран 40—50 нм. Функция эндоплазматического ретикулума заключается в обеспечении транспорта различных веществ (белков, ионов, углеводов) по клетке. Мембраны представляют собой большие активные поверхности, на которых локализуются различные ферментные системы. На эндоплазматической сети расположены рибосомы.

Рибосомы представляют собой ультрамикроскопические гранулы, состоящие из белка (58 % СВ) и РНК — рибонуклеиновой кислоты (42 % СВ), связанных между собой в виде надмолекулярного комплекса. Нуклеиновые кислоты и белки в рибосомах удерживаются вместе при помощи слабых нековалентных сил — ионных взаимодействий и Ван-дер-ваальсовых сил. В них осуществляется синтез белков и ферментов. Рибосомы находятся как в массе цитоплазмы и ядра клеток, так и в митохондриях. При расположении на поверхности мембраны они обладают активностью. Рибосомы содержатся во всех клетках, включая бактериальные. Рибосома состоит из двух неравных частей, или субъединиц (рис. 2.5).

Каждая рибосомная субъединица представляет собой компактно свернутый рибонуклеопротеидный тяж (РНП-тяж). Рибосомы являются местом белкового синтеза. Рибосомные белки существенно стабилизируют вторичную структуру РНК, в то же время рибосомная РНК представляет собой ковалентно-непрерывный каркас, определяющий уникальное расположение белковых субъединиц в субчастицах рибосом. В этом и состоит биологическая роль рибосомных РНК. По размерам и молекулярной массе рибосомы разделяются на две четкие группы: первая — мелкие рибосомы бактерий, актиномицетов, митохондрий; вторая — более крупные цитоплазматические рибосомы всех эукариотических организмов, включая дрожжи, грибы, водоросли, высшие растения и животных.

Эукариотические рибосомы по сравнению с бактериальными содержат на 30—40 % больше РНК, а также белка; их молекулярная масса составляет от 4 до 5 млн, а у бактериальных — около 2,8 млн.

В клетках бактерий рибосомы расположены в цитоплазме свободно, а в дрожжевых клетках — или свободно в виде полисом, состоящих из 5—6 рибосом, или большей частью связаны с внешней поверхностью мембран эндоплазматической сети, где они располагаются рядами.

Аппарат Гольджи — мембранное образование, морфологически связанное с эндоплазматической сетью и с нуклеолеммой. Роль аппарата заключается в выводе вредных веществ из клетки, обеспечении защитных функций, транспорте веществ между другими структурными компонентами и участии в образовании новых структурных элементов. В них локализуются ферменты, катализирующие разрушение биополимеров. Мембраны аппарата Гольджи являются местом образования лизосом.

Лизосомы представляют собой электронно-плотные гранулы, которые отделены от цитоплазмы однослойной липопротеидной мембраной. Они защищают клетку от повреждений продуктами распада и чужеродными агентами.

Вакуоли — производные аппарата Гольджи — являются структурой, изолирующей продукты распада и аккумулирующей чужеродные токсические вещества. Вакуоли ретикулярного происхождения служат местом депонирования белков, липидов и запасных веществ клетки — волютина, жира, гликогена, трегалозы, полифосфатов, сахаров и минеральных солей. Вакуоли участвуют в осмотической регуляции и являются местом различных окислительно-восстановительных процессов. Вакуолярный аппарат образуется в клетках с возрастом. В почках и клетках молодой культуры он, как правило, отсутствует.

Митохондрии — сферические или удлиненные автономные органеллы, содержащие ферментные системы. В функции митохондрий, связанных с мембранами, входят окислительное фосфорилирование, транспортирование субстратов, кофакторов и ионов, перенос электронов по цепи реакций синтеза АТФ и синтез части митохондриальных белков. Митохондрии покрывает оболочка, состоящая из двух мембран. На поверхности внутренней мембраны расположены частицы, участвующие в переносе электронов. На поверхности внешней мембраны происходят окислительные реакции трикарбоновых кислот или цикла Кребса и окисление жирных кислот. В результате деятельности митохондрий на каждую перенесенную пару электронов образуются три молекулы АТФ — универсальных источников энергии для жизненных процессов в клетке.

В клетках дрожжей, перенесенных из аэробных условий (период культивирования) в анаэробные (период брожения в хлебопекарных полуфабрикатах), митохондрии теряют выраженную форму и образуются мембраны неопределенной конфигурации.

Митохондрии отделены от цитоплазмы двухслойной мембраной (рис. 2.6). Двухслойная оболочка по всему объему митохондрии образует складки, выступающие внутрь этих частиц. Эти перегородки (кристы, или гребень) сильно увеличивают внутреннюю поверхность, на которой располагаются ферменты.

В митохондриях синтезируются вещества, запасающие химическую энергию клетки. Поэтому не случайно их называют энергетической подстанцией клетки. Установлена способность митохондрий к самовоспроизведению. В табл. 2.1 приведены некоторые характерные свойства мембран, межмембранного пространства и матрикса.

По своему ферментативному и липидному составу наружная мембрана сходна с эндоплазматической сетью. Внутренняя митохондриальная мембрана чрезвычайно сложна и уникальна по составу. Содержащиеся в ней ферменты катализируют некоторые этапы биосинтеза и многочисленные транспортные системы.

Рис. 2.6. Схема строения митохондрии:

а — общая схема строения;  б —  схема грибовидных тел внутренних мембран; 1, 3 —  наружная и внутренняя  мембраны; 2 —  межмембранное пространство;  4 —  матрикс; 5 —  кристы; 6 —  головка; 7 — стержень; 8  —  базальная пластинка (мембрана)

Таблица 2.1