Молекулярные механизмы ферментативного катализа

При ферментативных превращениях происходит множество взаимосвязанных процессов и явлений на пути превращения субстрата в продукт биохимической реакции. Механизмы ферментативного катализа определяются природой субстрата и функциональных групп активного центра фермента.

Большую роль в развитии представлений о механизме действия ферментов сыграли классические работы Михаэлиса и Ментен, развивших положение о фермент-субстратных комплексах. Согласно этому положению весь процесс ферментативного катализа описывается простым уравнением:

                                   1     2        3           4

E + S ↔ ES ↔ ES* ↔ EP → E + P

где: Е – фермент, S – субстрат, S* – активированный субстрат, Р – продукт реакции.

Процесс ферментативного катализа можно условно разделить на четыре стадии, каждая из которых имеет свои особенности:

1. Диффузия субстрата к ферменту и его стерическое связывание в активном центре (образование нестойкого фермент-субстратного комплекса ЕS). В субстратном центре с помощью слабых взаимодействий связывается та часть молекулы субстрата, которая не подвергается химическим превращениям. Данная стадия, обычно непродолжительная по времени, зависит от концентрации субстрата в среде и скорости его диффузии к активному центру фермента.

2. Изменение субстрата под действием фермента, делающее его доступным для химической реакции. На данной, наиболее медленной по времени стадии, происходит активация субстрата за счет:

- поляризации химических связей в молекуле субстрата и перераспределения электронной плотности;

- деформации связей, вовлекаемых в реакцию;

- сближения и необходимой взаимной ориентации молекул субстрата.

Молекула субстрата фиксируется в активном центре фермента в напряженной конфигурации, в деформированном состоянии, что приводит к ослаблению прочности химических связей и снижению уровня энергетического барьера. Другими словами происходит образование активированного фермент-субстратного комплекса (ES*). Эта вторая стадия лимитирует скорость всего катализа.

3. Химическая реакция, в ходе которой происходит превращение субстрата в продукт за счёт разрыва и замыкания ковалентных связей.

4. Фермент переходит в исходное состояние с отделением продуктов реакции. Данная непродолжительная стадия определяется скоростью диффузии продуктов в окружающую среду.

В образовании фермент-субстратного комплекса у сложных ферментов принимают участие апофермент и кофермент. При этом субстратный центр располагается обычно на апоферменте, а кофермент принимает участие непосредственно в акте химического превращения субстрата. На последней стадии реакции апофермент и кофермент выделяются в неизменном виде.

Для образования фермент-субстратного комплекса (ES) необходимо соблюдение трех условий, которые и определяют высокую специфичность действия фермента:

1. Структурное соответствие между субстратом и активным центром фермента. Это подобие обеспечивается на уровне третичной структуры фермента, т.е. пространственного расположения функциональных групп активного центра.

Механизм сближения и ориентации

Фермент способен связывать молекулу субстрата таким образом, что атакуемая им связь оказывается не только расположенной в непосредственной близости от каталитической группы, но и правильно ориентированной по отношению к ней. В результате вероятность того, что комплекс ES достигнет переходного состояния, сильно увеличивается.

Механизм индуцированного соответствия

Связывание субстрата в ряде случаев может вызывать конформационные изменения в молекуле фермента, которые приводят к напряжению структуры активного центра, а также несколько деформируют связанный субстрат, упрощая тем самым достижение комплексом ES переходного состояния. При этом возникает так называемое индуцированное соответствие фермента субстрату. Таким образом, небольшие изменения третичной или четвертичной структуры относительно крупной молекулы фермента могут играть роль механического рычага для молекулы субстрата. Возможно, именно по этой причине ферменты представляют собой белки и, следовательно, по своим размерам значительно превосходят молекулы большинства субстратов.

Кислотно-оснóвный катализ

Концепция кислотно-оснóвного катализа объясняет ферментативную активность участием в химической реакции кислотных групп (доноры протонов) и/или оснóвных групп (акцепторы протонов). Кислотно-оснóвный катализ – часто встречающееся явление. Аминокислотные остатки, входящие в состав активного центра, имеют функциональные группы, проявляющие свойства, как кислот, так и оснований.

К аминокислотам, участвующим в кислотно-оснóвном катализе, в первую очередь относят Cys, Tyr, Ser, Lys, Glu, Asp и His. Радикалы этих аминокислот в протонированной форме – кислоты (доноры протона), в депротонированной – основания (акцепторы протона).

При фиксации субстрата в активном центре на его молекулу влияют электрофильные и нуклеофильные группы каталитического участка, что вызывает перераспределение электронной плотности на участках субстрата, атакуемого кислотно-оснóвными группами. Это облегчает перестройку и разрыв связей в молекуле субстрата. Ярко выраженной способностью к кислотно-оснóвному катализу обладают ферменты, в каталитическом центре которых имеется гистидин, который отличается отчётливыми кислотно-оснóвными свойствами. При блокировании гистидина фермент инактивируется.

Данный механизм ферментативного катализа характерен для гидролаз, лиаз, изомераз. Он часто сочетается с ковалентным катализом.

Ковалентный катализ

Ковалентный катализ основан на атаке нуклеофильных (отрицательно заряженных) или электрофильных (положительно заряженных) групп активного центра фермента молекулами субстрата с формированием ковалентной связи между субстратом и коферментом или функциональной группой аминокислотного остатка (как правило, одной) активного центра фермента. Ковалентные фермент-субстратные промежуточные продукты очень неустойчивы и легко распадаются, освобождая продукты реакции. Действие сериновых протеиназ, таких как трипсин, химотрипсин, эластаза и тромбин, – пример механизма ковалентного катализа, когда ковалентная связь образуется между субстратом и остатком серина в активном центре фермента.

Для большинства ферментов характерно сочетание описанных механизмов, что обеспечивает их высокую каталитическую активность.