Количественное определение ферментативной активности

Определить количественное содержание фермента в биологических объектах достаточно трудно, т.к. он присутствует в тканях в ничтожно малых концентрациях. Поэтому о количестве фермента судят по скорости катализируемой им реакции в стандартных условиях (t = 25°С, оптимальное значение рН, при полном насыщении фермента субстратом), и выражают в условных единицах.

За единицу активности фермента (Е – рус./нем. или U – англ./исп.) принимают такое количество фермента, которое в стандартных условиях катализирует превращение 1 мкмоль субстрата в минуту (1 мкмоль/мин). Эта стандартная международная единица выражения количества фермента и его активности введена в 1962 г. Международным биохимическим союзом. В Международной системе единиц СИ (1972 г.) предложена, вместо старой безымянной единицы ферментативной активности (Е или U), новая единица ферментативной активности – катал. 1 катал – это количество фермента, обеспечивающее превращение 1 моля субстрата в 1 секунду в стандартных условиях. Поскольку реакции идут гораздо с меньшей скоростью, то активность выражают в микро-, нано- и пикокаталах. 1Е = 16,67 нкат.

Для характеристики активности ферментов на практике часто используют следующие понятия:

1. Удельная активность – это число единиц ферментативной активности на 1 мг фермента, т.е. число мкмолей субстрата, превращаемое в 1 мин /1 мг фермента. Удельная активность выражается также числом каталов на 1 кг фермента (кат/кг);

2. Молярная активность – выражается в каталах на 1 моль фермента;

3. Молекулярная активность – это число молекул субстрата, превращенное в 1 мин 1 молекулой фермента. Например, молекулярная активность каталазы = 5 мин;

4. Концентрация фермента – выражается в единицах ферментативной активности Е на 1 мл раствора.

Факторы, влияющие на активность ферментов

На активность ферментов и, соответственно, скорость ферментативной реакции влияют, в основном, следующие физико-химические факторы: концентрация фермента [E₀] и субстрата [S], температура, значение показателя концентрации водородных ионов – рН, присутствие активаторов или ингибиторов.

Концентрация фермента

В определенных условиях скорость ферментативной реакции прямо пропорциональна количеству фермента. Однако это утверждение не всегда бывает верным, что можно показать на примере реакции, протекающей в условиях равновесия. Даже если известно, что прямая реакция действительно идет, кажется, что ее скорость равна нулю, поскольку с такой же скоростью идет и обратная реакция. В самом же начале ферментативной реакции, когда продукт еще практически отсутствует, обратная реакция идти не может. Кроме того, на начальной стадии реакции концентрация субстрата практически соответствует его исходному количеству. Поэтому скорость реакции в начальные промежутки времени, т.е. начальная скорость, будет прямо пропорциональна концентрации фермента.

Рисунок 5.4 – Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермента.

Концентрация реагентов

Увеличение концентрации реагирующих веществ приводит к возрастанию числа молекул, обладающих достаточной для реакции энергией и к росту частоты их столкновений. Рассмотрим реакцию между двумя разными молекулами А и В:

А + В → АВ

Удвоение концентрации [А] или [В] по отдельности приведет к увеличению скорости реакции в два раза, а одновременное удвоение концентраций [А] и [В] повысит вероятность их столкновений вчетверо и скорость реакции возрастет в четыре раза (квадратные скобки используют для выражения содержания реагирующих веществ в молярной концентрации). Следовательно, скорость реакции пропорциональна концентрациям реагирующих молекул.

Температура

С повышением температуры, в пределах некоторого весьма ограниченного интервала температур, скорость реакций, катализируемых ферментами, увеличивается. Коэффициент, показывающий, во сколько раз увеличивается скорость реакции при повышении температуры на 10°, называется температурным коэффициентом Вант-Гоффа и обозначается Q₁₀. Для большинства химических реакций, а также многочисленных биохимических реакций повышение температуры на 10° приводит к увеличению скорости процесса в 2-3 раза (т.е. коэффициент Q₁₀ равен 2-3) и, аналогично, при понижении температуры на 10° скорость уменьшается в 2-3 раза. Многие физиологические процессы (например, скорость сокращения изолированной сердечной мышцы) также подчиняются этому правилу. Типичная зависимость скорости ферментативной реакции от температуры представлена на Рис. 5.5.

Как можно видеть из графика, при некой оптимальной температуре скорость реакции максимальна. Рост скорости реакции по мере приближения температуры к оптимальному значению объясняется увеличением кинетической энергии реагирующих молекул, т.е. увеличением частоты сталкивания молекул фермента и субстрата. При дальнейшем росте температуры кинетическая энергия молекул самих ферментов оказывается достаточной для разрыва внутримолекулярных связей, поддерживающих их вторичную и третичную структуры в необходимом каталитически активном состоянии, что приводит к потере их каталитической активности.

Рисунок 5.5 – Влияние температуры на скорость гипотетической ферментативной реакции.

Для большинства ферментов оптимальной температурой является та температура, при которой в норме функционируют клетки. Для ферментов некоторых микроорганизмов, адаптировавшихся к обитанию в естественных горячих источниках, оптимальная температура может быть близка к точке кипения воды.

Значение рН среды

Активность ферментов зависит от рН раствора, в котором протекает ферментативная реакция. Для каждого фермента существует оптимальное значение рН, при котором наблюдается его максимальная активность.

Оптимум рН для большинства ферментов организма человека совпадает с его физиологическим значением и находится в интервале 6,0-8,0 (Рис. 5.6).

Рисунок 5.6 – Зависимость начальной скорости реакции, катализируемой глюкозо-6-фосфатазой от рН среды.

Вместе с тем отдельные ферменты активны при значениях рН, лежащих далеко за пределами этого интервала, например наибольшую активность пепсин проявляет при рН 2,0, трипсин – при рН 7, а папаин вообще не чувствителен к изменению рН в диапазоне от 4,0 до 8,0 (Рис. 5.7).

Рисунок 5.7 – Зависимости активностей пепсина, трипсина, папаина и холинэстеразы от рН среды.

При отклонении рН от оптимальных значений происходит изменение ионизации функциональных групп молекулы фермента. Например, в кислой среде происходит протонирование свободных аминогрупп (–NH₃⁺), а в щелочной – отщепление протона от карбоксильных групп (–СОО^–). Это приводит к изменению конформации фермента и его активного центра. Следовательно, нарушается способность активного центра связывать субстраты, коферменты. Кроме того, рН среды может влиять на степень ионизации или пространственную организацию субстрата, что также влияет на сродство субстрата к активному центру. При значительном отклонении от оптимального значения рН может происходить денатурация белковой молекулы с полной потерей ферментативной активности.