ТАБЛИЦЯ 4-1 Вторинні структури і властивості фібрилярних протеїнів

Структура                                 Характеристика                                Приклади

РИС. 4-12 Структура колаґену.(Отримано з PDB ID 1CGD.) (a)α-Ланцюг колаґену містить притаманну тільки цьому протеїну повторювану вторинну структуру. Повторювана трипептидна послідовність Gly-X-Pro, або Gly-X-4-Нур, утворює закручену вліво спіральну структуру, яка містить три амінокислотних залишки на один поворот. Для наведеної моделі було використано повторювану послідовність Gly-Х-4-Нур (б)Просторова модель тієї ж α-спіралі. (в) Три такі спіралі, (помічено сірим, блакитним та синім) закручені одна навколо іншої і утворюють правозакручену структуру, схожу на «канат». (г) Кульково-стрижнева модель триниткової надспіралі колаґену, вигляд з торця. Залишки Gly позначено червоним кольором. Завдяки своєму малому розміру тільки молекула гліцину може розміститися у місці тісного контакту трьох ланцюгів. Розміри кульок на малюнку не відповідають радіусам ван дер Ваальса окремих атомів. Центральна частина надспіралі не порожня, як це може здатися із рисунка, а упакована дуже щільно.

РИС. 4-13 Структура колаґенових фібрил.Молекула колаґену (M_r. 300000) має форму стрижня завдовжки близько 3000 Å і завтовшки лише 15Å. Його три скручені α-ланцюги можуть мати різні послідовності, але кожен з них містить близько 1 000 амінокислотних залишків. Волокна колаґену утворені відповідно вирівненими молекулами, зміщеними по відношенню одна до одної і перехресно зв’язаними для міцності. Особливості вирівнювання і ступінь перехресного з’єднання молекул залежать від типу тканини і утворюють на електронних мікрофотографіях характерні поперечні смуги. У наведеному тут прикладі вирівнювання групп голови кожної четвертої молекули утворює повторювані поперечні смуги, відстань між якими складає 640 Å.

250 нм   Голови молекул колаґену Поперечні смуги              640 Å (64 нм)

Частина молекули колаґену.

РИС. 4-14 Структура шовку. Фібрили, з яких складається шовкова тканина або павутина павука, утворені із протеїну фіброїну. (а)Фіброїн містить шари антипаралельних β-складок, багатих на залишки Ala (фіолетові) і Gly (жовті). Невеликі бічні ланцюги взаємодоповнюють один одного, що сприяє щільній упаковці складок, як це видно на даному зображенні збоку. (б)На цій кольоровій електронній мікрофотоґрафії видно нитки фіброїну (блакитні) в момент їх виділення павуком.

Бічний ланцюг Ala           Бічний ланцюг Gly 70 мкм

РИС. 4-15 Структури ґлобулярних протеїнів характеризуються компактністю і різноманітністю. Альбумін сироватки людини (M_r 64 500) містить 585 залишків в одному ланцюзі. На рисунку показано, які приблизні розміри мав би його єдиний поліпептидний ланцюг у повністю видовженій β-конформації, або у вигляді α-спіралі. Також наведено розмір молекули протеїну у його нативній ґлобулярній формі, визначений методом рентгенівської кристалографії; для набуття такого розміру пептидний ланцюг мусить згорнутися дуже щільно.

β-Конформація α-Спіраль Нативна ґлобулярна форма.

РИС. 4-16 Третинна структура міоґлобіну кашалота.(PDB ID 1MBO) Орієнтація протеїну подібна на всіх зображеннях; гемова група позначена червоним. Окрім структури міоґлобіну, цей рисунок демонструє також декілька різних способів зображення структури протеїнів. (а) Поліпептидний ланцюг наведено в запропонованій Джейн Річардсон стрічкоподібній формі, яка підкреслює ділянки вторинної структури. Чітко видно α-спіральні ділянки. (б) Зображення у вигляді "сітки" вирізняє поверхню протеїну. (в)Зображення контура поверхні зручне для візуалізації заглибин («кишень») у структурі протеїнів, які звичайно служать місцями зв'язування інших молекул. (г) Зображення стрічкоподібної стуктури з бічними ланцюгами гідрофобних залишків Leu, Ile, Val та Phe (позначено синім). (ґ) Просторова модель з бічними ланцюгами всіх амінокислот. Кожен атом зображений кулькою, розмір якої пропорційний до радіуса ван дер Ваальса. Гідрофобні залишки позначено синім кольором; більшість з них перебуває всередині молекули і невидимі на цьому зображенні.

РИС. 4-17 Гемогрупа.Ця група входить до складу міоґлобіну, гемоґлобіну, цитохрому і багатьох інших гемових протеїнів. (а) Гем містить складну орґанічну кільцеву структуру протопорфірин, з яким зв'язаний атом заліза в окисненому (Fe²⁺) стані. Атом заліза має шість координаційних зв'язків, чотири з яких знаходяться в площині плоскої молекули порфірину і зв'язані з нею, а два інші розміщені перпендикулярно. (б) У міоґлобіні і гемоґлобіні одним із перпендикулярних координаційних зв’язків є зв’язок з атомом азоту залишку His. Інший зв’язок "відкритий" і служить для зв'язування молекули О₂.

РИС. 4-18 Тривимірні структури деяких малих протеїнів.Зображено структури цитохрому с (PDB ID 1CCR), лізоциму (PDB ID 3LYM) і рибонуклеази (PDB ID 3RN3). Зображення кожного протеїну наведено у вигляді контура поверхні і стрічкоподібної структури, орієнтація однакова. У стрічкоподібній структурі ділянки у β-конформації позначені плоскими стрілками, а α-спіралі – спіральними стрічками. Головні функціональні групи (гем в цитохромі с, амінокислотні бічні ланцюги в активних центрах лізоциму і рибонуклеази) позначено червоним, дисульфідні зв'язки (у стрічкоподібних структурах) – жовтим кольорами.

Цитохром с   Лізоцим Рибонуклеаза

ТАБЛИЦЯ 4-2 Приблизна кількість α-спіралей і β-конформацій у складі деяких одноланцюгових протеїнів.

                                                    Залишків (%)*

Протеїн (всього залишків)                  α-Спіраль       β-Конформація

Хімотрипсин (247)                              14                             45

Рибонуклеаза (124)                             26                             35

Карбоксипептидаза (307)                   38                             17

Цитохром с (104)                                          39                             0

Лізоцим (129)                                      40                             12

Міоґлобін (153)                              78                             0

Джерело: Cantor, C.R. & Schimmel, P.R. (1980) Biophysical Chemistry, Part I: The Conformation of Biological Mаcromolecules, p. 100, W.H. Freeman and Company, New York.

^*Окремі ділянки пептидних ланцюгів, які не входять до складу α-спіралей чи β-конформацій, утворюють згини і нереґулярно закручені чи витягнуті відрізки. Іноді сеґменти α-спіралей і β-конформацій дещо відрізняються від їхніх нормальних розмірів і ґеометрії.

РИС. 4-19 Структурні домени поліпептиду тропоніну С.(PDB ID 4TNC). Цей кальцій-зв'язувальний протеїн м'язів має два окремі кальцій-зв'язувальні домени, зображені синім і пурпуровим кольорами.

РИС. 4-20 Стабільні способи згортання в молекулах протеїнів. (а)Два прості поширені мотиви, які забезпечують існування двох шарів вторинних структур. Бічні ланцюги амінокислотних залишків на поверхні розподілу між елементами вторинної структури захищені від взаємодії з водою. Зауважте, що β-нитки в β-α-β ‑ петлі мають тенденцію закручуватися вправо. (б)З'єднання між β-нитками у шарах β-складок. Вигляд ниток показано з торця і у нескрученному стані. Товщі лінії зображають з’єднання на кінцях, ближчих до спостерігача, тонші - на віддалених кінцях β-ниток. З'єднання на певному кінці (наприклад, ближчому до спостерігача) не перетинаються між собою. (в)Завдяки скручуванню β-ниток, з'єднання між ними зазвичай закручені вправо. Лівозакручені з’єднання повинні перетинати гостріші кути і утворюються важче. (г) Два види впорядкування β-ниток, стабілізовані завдяки їхній здатності до закручування. Цей β-циліндр є окремим доменом α-гемолізину (токсин, який утворює пори, і знищує клітини за рахунок виникнення дірки в їхній мембрані) з бактерій Staphylococcus aureus (отримано з PDB ID 7AHL). Закручена β-складка міститься в домені фотоліази (протеїну, який відновлює окремі типи ушкодження ДНК) з E. coli (отримано з PDB ID 1DNP).

(а)Петля β-α-β Кут α-α

(б)Типові з'єднання в повністю-стандартному β-мотиві Перехресне з'єднання (не спостерігається)

(в) Правозакручене з'єднання між β-нитками      Лівозакручене з'єднання між β-нитками (зустрічається дуже рідко)

(г) β-Циліндр Закручена β-складка

РИС. 4-21 Побудова великих мотивів із менших.Поширеним мотивом єα/β-циліндр, який утворюється із повторень простішого мотиву- петлі β-α-β. Наведений α/β-циліндр – домен піруваткінази (ґліколітичного ензиму) кроля (отримано з PDB ID 1PKN).

β-α-β‑Петля        α/β-Циліндр

РИС. 4-22 Класифікація протеїнів на основі їхніх мотивів.Тут наведено лише незначну частину з сотень відомих стабільних мотивів. Їх розподіляють на чотири класи: всі α (тобто, лише α-мотиви), всі β, α/β і α+β. Також наведено стуктурну класифікацію із бази даних SCOP (Structural Classification Of Proteins, http://scop.mrc-lmb.cam.ac.ul/scop). Ідентифікатор PDB - номер, який присвоюється кожній структурі, занесеній в Протеїновий Банк Даних (www.rcsb.org/pdb). Зображений на Рис. 4-21 α/β-циліндр є прикладом ще одного особливо поширеного α/β-мотиву.

PDB - ідентифікатор

Згортка

Надродина         

Родина

Протеїн

Вид

Всі α

Всі β

α/β

α+β

Портрети - Макс Перутц (зліва) Джон Кендрю (справа)

РИС. 4-23 Четвертинна структура дезоксигемоґлобіну. (PDB ID 2HHB). Аналіз дезоксигемоґлобіну (гемоґлобіну, який не містить молекул кисню, зв’язаних з гемовими групами) методом дифракції рентгенівських променів допоміг з’ясувати спосіб спільної упаковки чотирьох субодиниць. (а) Зображення у вигляді стрічкоподібної структури. (б)Просторова модель. α-Субодиниці зображено сірим і блакитним кольорами, β-субодиниці - рожевим і синім. Зауважте, що групи гему (червоні) віддалені одна від одної.

РИС. 4-24 Обертова симетрія в протеїнах. (а)У випадку циклічної симетрії субодиниці суміщаються внаслідок обертання навколо однієї осі n-го порядку, де n - кількість субодиниць. Осі позначено чорними лініями, цифри відповідають значенню n. На рисунку наведено лише дві з багатьох можливих С_n – конфігурацій. (б)У випадку діедричної симетрії всі субодиниці можуть суміститися шляхом обертання навколо однієї чи обох із двох наявних осей, одна з яких - вісь другого порядку. Найпоширенішою є симетрія D₂. (в) Ікосаедрична симетрія. Для суміщення всіх 20 трикутних граней ікосаедра його необхідно обертати навколо однієї або кількох із трьох окремих осей - другого, третього і п'ятого порядку. Справа наведено вигляд з торця  кожної з цих осей.

(а) Два типи циклічної симетрії       Другого порядку    Третього порядку

(б) Два типи діедричної симетрії     Другого порядку-3 рази (D2)   Другого порядку -2 рази , Четвертого порядку (D4)

(в) Ікосаедрична симетрія П’ятого порядку     Третього порядку  Другого порядку

РИС. 4-25 Вірусні капсиди. (а)Поліовірус (отримано з PDB ID 2PLV). Протеїни оболонки поліовіруса об'єднані в ікосаедр діаметром 300 Å. Ікосаедрична симетрія є одним із типів обертової симетрії (див. Рис. 4-24в). Зліва наведено зображення контура поверхні поліовірусної капсиди. На зображення справа накладено лінії, що підкреслюють положення осей симетрії. (б)Вірус тютюнової мозаїки (отримано з PDB ID 1VTM). Цей вірус має форму палочки (як видно з електронної мікрофотографії) завдовжки 3 000 Å і з діаметром 180 Å; для нього характерна спіральна симетрія.

РНК       Субодиниця протеїну

РИС. 4-26 Денатурація протеїнів.Наведено результати денатурації протеїнів під дією двох факторів. В обох випадках перехід зі згорненого до незгорненого стану відбувається досить різко, що свідчить про кооперативність процесу розгортання. (а) Теплова денатурація апоміоґлобіна коня (міоґлобіна без простетичної гемогрупи ) і рибонуклеази А (що містить інтактні дисульфідні зв'язки, див. Рис. 4-27). Середня точка інтервалу температури, в якому відбувається денатурація, називається температурою плавлення, або T_m. Денатурація апоміоґлобіну відслідковувалася методом циркулярного дихроїзму, який вимірює вміст спіральних структур в макромолекулі. Денатурацію рибонуклеази А простежували за зміною власної флюоресценції протеїну, на яку впливають зміни в оточенні залишків Trp. (б) Денатурація рибонуклеази А (з дисульфідними зв'язками) під дією ґуанідингідрохлориду (GdnHCl), визначена методом циркулярного дихроїзму.

(а) Процент від максимального сигналу Температура           Рибонуклеаза А    Апоміоглобін

(б) Процент розгорненого протеїну Рибонуклеаза А

РИС. 4-27 Ренатурація розгорненої, денатурованої молекули рибонуклеази.Для денатурації рибонуклеази використовують сечовину і меркаптоетанол (НОСН₂СН₂SH), який відновлює (а, отже, розщеплює) дисульфідні зв'язки з утворенням восьми залишків Cys. У разі ренатурації відбувається поновлення поперечних дисульфідних зв'язків у вихідних положеннях.

Нативний, каталітично активний стан.

додавання сечовини і меркаптоетанолу

Розгорнений стан, неактивний. Дисульфідні поперечні зв'язки відновлені з утворенням залишків Cys.

видалення сечовини й меркаптоетанолу

Нативний, каталітично активний стан. Дисульфідні поперечні зв'язки поновлено

РИС. 4-28 Моделювання процесу згортання протеїну. За допомогою комп'ютера було змодельовано процес згортання фраґмента протеїну віліну (актин-зв'язувальний протеїн, міститься переважно у мікроворсинках кишкового епітелію), що складається із 36 амінокислотних залишків. Вихідні дані - хаотично спіралізований пептид, оточений 3000 молекул води у вигляді можливої "водної оболонки". Для виділення найбільш ймовірних підходів з метою встановлення остаточної структури, із нескінченно великого числа інших можливостей враховувалися молекулярні рухи пептиду і вплив молекул води. Модель дозволила теоретично оцінити час згортання протеїну як величину порядка 1 мс; проте для обчислення необхідних півмільярда інтеґраційних етапів знадобилося два місяці роботи на двох Cray-суперкомп'ютерах.

РИС. 4-29 Термодинаміка згортання протеїнів, зображена у вигляді вільноенерґетичної лійки. У верхній частині лійки число можливих конформацій, а отже і конформаційна ентропія, високі. Тут наявна лише незначна частина внутрішньомолекулярних взаємодій, характерних для нативної конформації. У ході згортання переміщення термодинамічнм шляхом вниз по лійці зменшує число можливих конформацій (зменшуючи ентропію), при цьому зростає частка протеїну у нативній конформації і зменшується вільна енерґія. Заглиблення на стінках лійки відповідають напівстабільним проміжним станам згортання, які в певних випадках можуть сповільнити весь процес.

Початок утворення спіралі і колапс Ентропія Стани розплавленої ґлобули    Окремі проміжні стани згортання Нативна структура

Енергія  Процент протеїну у нативній конформації

РИС. 4-30 Роль шаперонів у згортанні протеїнів.Циклічний процес, впродовж якого шаперони зв'язують і вивільняють поліпептиди, проілюстровано на прикладі шаперонових протеїнів E. coli DnaK і DnaJ, що є гомологами еукаріотичних шаперонів Hsp70 і Hsp40. Шаперони помітним чином не прискорюють згортання протеїнів, вони лише перешкоджають агрегації незгорнених пептидів. Після проходження циклу певна частина популяції пептидів набуває нативної конформації. Інші знову зв'язуються з DnaK або спрямовуються до системи шаперонінів (GroEl; див. Рис. 4-31). У бактерій в кінці циклу (етап 3) протеїн GrpE тимчасово взаємодіє з DnaK, сприяючи вивільненню ADP і, можливо, DnaJ. У клітинах еукаріотів не виявлено аналоґів GroEl.

Сектор1, знизу: Незгорнений протеїн

DnaJ зв'язується із незгорненим чи частково згорненим протеїном, а пізніше - з DnaK            

2. DnaJ стимулює гідроліз ATP під дією DnaK. Комплекс DnaK-ADP міцно зв'язується з незгорненим протеїном    

3. У бактерій нуклеотид-обмінний фактор GrpE стимулює вивільнення ADP      4. ATP зв'язується з DnaK і протеїн відділяється    

Згорнений протеїн (нативна конформація) До системи GroEL  Частково згорнений протеїн

РИС. 4-31 Роль шаперонінів узгортанні протеїнів. (а)Пропонований механізм дії шаперонінів клітин E. Coli - GroEL (належить до родини протеїнів Hsp60) і GroES. Кожен GroEL-комплекс складається із двох великих «кишень», утворених двома гептамерними кільцями (M_r кожної з субодиниць складає 57 000). GroES, також гептамер (M_r кожної субодиниці - 10 000), блокує одну з «кишень» у складі GroEL. (б) Зображення поверхні і зрізу комплексу GroEL/GroES (отримано з PDB ID 1AON). На зрізі (справа) видно велику внутрішню порожнину, всередині якої зв'язані інші протеїни.

1. Незгорнений протеїн зв'язується з «кишенею» GroEL, не заблокованою GroES.

Незгорнений протеїн  

2. ATP зв'язується з кожною субодиницею гептамера GroEL.

3. Гідроліз ATP призводить до виділення 14 ADP і GroES.

4. 7 ATP і GroES зв'язуються із GroEL,  «кишеня» якого заповнена.

5. Протеїн згортається всередині порожнини.

6. Вивільнений протеїн перебуває в повністю, або частково згорненому стані, здатному набути природної конформації.     Згорнений протеїн

7. Вивільнені незгорнені протеїни знову швидко зв'язуються з комплексом