Третинну структуру протеїну визначає амінокислотна послідовність

Третинна структура глобулярних протеїнів залежить від їхньої амінокислотної послідовності. Найістотніше підтвердження цього факту було отримано при експериментальному дослідженні оборотної денатурації протеїнів. Деякі ґлобулярні протеїни, денатуровані нагріванням, крайніми значеннями рН або денатуруючими аґентами, здатні відновлювати свою структуру і біологічну активність у разі поверненні до умов, за яких їхня нативна конформація стабільна. Цей процес називається ренатурацією.

Класичним прикладом вищенаведеного є денатурація і ренатурація рибонуклеази. Очищену рибонуклеазу можна повністю денатурувати дією концентрованого розчину сечовини у присутності відновника. Відновник розщеплює чотири дисульфідні зв'язки з утворенням восьми залишків Cys, а сечовина розриває стабілізуючі гідрофобні взаємодії і вивільняє поліпептид у розгорнутій конформації. Денатурація рибонуклеази супроводжується повною втратою каталітичної активності. Якщо ж видалити сечовину і відновник, то спіралізована випадковим чином денатурована рибонуклеаза самочинно згортається у правильну третинну структуру з повністю відновленою каталітичною активністю (Рис. 4-27). Таке повторне згортання рибонуклеази настільки точне, що чотири внутрішні дисульфідні зв'язки знову утворюються в ренатурованій молекулі у тих же положеннях, що і в нативному протеїні. Математично підраховано, що випадкове рекомбінування восьми залишків Cys для утворення чотирьох дисульфідних зв'язків може відбуватися 105 різними способами. Дійсно, при відтворенні дисульфідних зв'язків у присутності денатуранта спостерігається дуже безладний їх розподіл у молекулі протеїна, що підтверджує необхідність слабких взаємодій для правильного розміщення дисульфідних зв'язків і утворення нативної конформації.

Цей класичний експеримент, проведений Хрістіаном Анфінсеном в кінці 1950-х років, надав перше свідчення того, що амінокислотна послідовність поліпептидного ланцюга несе в собі всю інформацію, необхідну для його згортання в нативну тривимірну структуру. Пізніше подібні результати отримано з використанням синтезованої хімічним способом каталітично активної рибонуклеази. Цими дослідами була виключена можливість того, що деяке незначне забруднення очищеного Анфінсеном препарата рибонуклеази могло призвести до ренатурації ензиму, а також виключено всі сумніви щодо можливості спонтанного згортання ензиму.

Згортання поліпептидів –  досить швидкий і багатоступеневий процес

Синтез протеїнів із амінокислот у живих клітинах відбувається з дуже великою швидкістю. Наприклад, клітини E. coli можуть утворити завершену молекулу біологічно активного протеїну зі 100 амінокислотних залишків приблизно за 5 секунд при 37^оС. Яким чином цей поліпептидний ланцюг набуває своєї нативної конформації? Якщо прийняти, що кожен амінокислотний залишок може в середньому мати 10 можливих конформацій, то в результаті може утворитися 10¹⁰⁰ різних конформацій поліпептида. Припустимо також, що протеїн згортається спонтанно випадковим чином, перебираючи всі можливі варіанти конформації навколо кожного зв'язку до отримання нативної біологічно активної форми. Якщо кожна конформація існує мінімально можливий час (~10^-13 с, середній час одного коливання молекули), то для перебору всіх можливих конформацій необхідно витратити 10⁷⁷ років. Отже, згортання протеїну не може бути простим перебором конформацій методом проб і помилок. Повинні існувати певні спрощення цього процесу. На цю проблему вперше звернув увагу Сайрус Левінталь 1968 р., тому іноді її називають парадоксом Левінталя.

Безумовно, механізм згортання великих поліпептидних ланцюгів складний і не всі визначальні принципи його повністю зрозумілі. Однак інтенсивне дослідження цього процесу призвело до розробки кількох ймовірних моделей. За однією із них згортання розглядається як ієрархічний процес. Спершу утворюються локальні вторинні структури. Певні амінокислотні послідовності легко згортаються в α-спіралі або β-складки відповідно до обмежень, які ми обговорили при розгляді вторинної структури. Далі відбуваються віддалені взаємодії, скажімо, двох α-спіралей з утворенням стабільної надвторинної структури. Процес продовжується до утворення завершених доменів і згортання всього ланцюга (Рис. 4-28). За альтернативною моделлю згортання починається з самочинного утворення компактного стану поліпептиду за рахунок гідрофобних взаємодій між неполярними залишками. Утворений внаслідок такого "гідрофобного колапсу" стан характеризується значною кількістю вторинних структур, але багато амінокислотних бічних ланцюгів остаточно не зафіксовані. Цей стан часто називають розплавленою ґлобулою. Швидше за все, процес згортання більшості протеїнів включає в себе певні елементи обох моделей. Замість одного механізму, група пептидних молекул може використовувати різні схеми згортання для досягнення одного і того ж кінцевого стану, причому кількість різних частково згорнутих конформаційних варіантів тим менша, чим ближче до закінчення цього процесу.

З точки зору термодинаміки процес згортання можна розглядати як вільноенерґетичну лійку (Рис. 4-29). Незгорнуті стани характеризуються високою конформаційною ентропією і відносно високою вільною енерґією. У процесі згортання воронка звужується, що відображає зменшення кількості можливих конформацій. Невеликі заглиблення вздовж сторін лійки відображають напівстабільні проміжні стани, які здатні сповільнювати процес згортання. На самому дні лійки можливі способи згортання зводяться до однієї нативної конформації (або набору кількох таких конформацій).

Помилки при згортанні протеїнів можуть бути молекулярною основою багатьох ґенетичних хвороб людини. Наприклад, захворювання кистозний фіброз викликає дефект мембранозв’язаного протеїну, названого трансмембранним регулятором провідності кистозного фіброзу (КФТР, або CFTR, з англ. cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) який функціонує в якості каналу для іонів хлору. Найбільш поширеною мутацією, що спричиняє кистозний фіброз, є делеція залишку Phe у положенні 508 молекули КФТР, що призводить до неправильного її згортання (див. Додаток 11-3). Багато захворювань, пов’язаних з мутаціями у колаґені (див. вище) також спричинені неправильним згортанням. Подальше дослідження принципів згортання протеїнів може призвести до розробки нових методів лікування як цих, так і багатьох інших захворювань (Додаток 4-5).

У структурі протеїну термодинамічна стабільність розподілена неоднаково, одна молекула містить ділянки високої і низької стабільності. Наприклад, протеїн може мати два стабільні домени, з’єднані сеґментом з низькою структурною стабільністю, або невелика частина домену може мати меншу стабільність, ніж решта. Ділянки з низькою стабільністю забезпечують зміну конформацій протеїну. Як ми побачимо в двох наступних розділах, різниця у стабільності різних ділянок усередині протеїну часто відіграє важливу роль в його функціонуванні.

 ___________________________________________________________________________