Процес згортання деяких протеїнів потребує допоміжних факторів

Під час синтезу у клітині не всі протеїни згортаються спонтанно. Процес згортання багатьох із них полегшується під впливом спеціалізованих протеїнів. До них належать молекулярні шаперони - протеїни, що взаємодіють з частково згорнутими чи неправильно згорнутими поліпептидами, сприяючи їх правильному згортанню або створюючи мікрооточення, в якому таке згортання може відбутися. Добре вивчено два класи молекулярних шаперонів, знайдених у широкого спектра орґанізмів - від бактерій до людини. Перший клас – це родина протеїнів Hsp70, які мають молекулярну вагу близько 70000 і більше поширені в клітинах, підданих високотемпературному стресові (звідси і їхня назва - heat shock proteins M_r 70000, або Hsp70). Ці протеїни зв'язуються з багатими на гідрофобні залишки ділянками незгорнених поліпептидів, запобігаючи їх неправильній агрегації. Отже, такі шаперони "захищають" денатуровані теплом протеїни, а також щойно синтезовані і ще незгорнені пептиди. Вони також блокують згортання певних протеїнів, які повинні залишатися у незгорненому стані до транслокації крізь мембрану (що описано в розділі 27). Деякі шаперони здатні полегшувати утворення четвертинних агрегатів оліґомерних протеїнів. Hsp70 зв'язують і вивільняють протеїни в циклічному процесі, який включає також кілька інших протеїнів (зокрема, клас Hsp40) і гідроліз ATP. На рис. 4-30 показано згортання протеїнів за участю шаперонів на прикладі протеїнів DnaK і DnaJ E. coli, гомолоґів Hsp70 і Hsp40 клітин еукаріотів. Протеїни DnaK і DnaJ вперше були ідентифіковані як такі, що необхідні для реплікації in vitro певних вірусних ДНК (звідси і позначення - Dna).

Другий клас шаперонів – це шапероніни,дуже складні комплекси протеїнів, необхідні для згортання низки інших клітинних протеїнів, нездатних до спонтанного згортання. Визначено, що за нормальних умов від 10% до 15% протеїнів E. coli для згортання потребують системи шаперонінів, названої GroEL/GroES (а в разі теплового стресу - до 30%). Спочатку було виявлено необхідність цих протеїнів для росту певних бактеріальних вірусів (з англ. «growth” означає “ріст”, звідси скорочення "Gro"). Незгорнені протеїни зв'язуються всередині «кишень» комплексу GroEL, які тимчасово накриваються комплексом GroЕS (Рис. 4-31). Далі відбуваються значні конформаційні зміни GroEL, спряжені з гідролізом ATP і зв'язуванням та вивільненням GroES, що пришвидшує згортання зв'язаного поліпептиду. Хоча структура комплексу GroEL/GroES вже відома, проте багато деталей механізму його дії все ще не з’ясовано.

І насамкінець необхідно відмітити, що спосіб згортання деяких протеїнів потребує участі двох ензимів, які каталізують реакції ізомеризації. Широко поширена протеїндисульфідізомераза (ПДІ)каталізує перерозподіл або переміщення дисульфідних зв'язків доти, доки не будуть сформовані зв’язки, властиві нативній конформації. Одна з функцій ПДІ полягає у каталізі реакції видалення проміжних згорнених структур з неправильними поперечними дисульфідними з’єднаннями. Ензим пептидпроліл-цис-трансізомераза (ППІ) каталізує взаємоперетворення цис- і транс- ізомерів пептидних зв'язків по залишках проліна (Рис. 4-8б), що може буди лімітуючим етапом у процесі згортання протеїнів, які містять частину зв'язків залишків Pro в цис-конформації.

Напевно, що згортання протеїнів у щільному клітинному середовищі відбувається складніше, ніж у пробірці. Цілком можливо, що у подальшому біохімічному дослідженні даної проблеми будуть відкриті нові класи протеїнів, які полегшують цей процес.

Підсумок 4.4 Денатурація та згортання протеїнів

-У процесі денатурації може руйнуватися тривимірна структура і змінюватися функції протеїнів, що свідчить про взаємозв'язок між цими властивостями. Деякі денатуровані протеїни можуть самочинно ренатурувати з утворенням біологічно активного протеїну, це вказує на те, що третинна структура протеїнів визначається їхньою амінокислотною послідовністю.

-Процес згортання протеїнів у клітинах, очевидно, відбувається упродовж декількох етапів. Спочатку можуть утворюватися ділянки вторинної структури, які потім згортаються у надвторинні структури. Великі ансамблі проміжних згорнених форм швидко набувають нативної конформації.

-Згортання багатьох протеїнів пришвидшується шаперонами Hsp70 та шаперонінами. Утворення дисульфідних зв'язків і цис-транс-ізомеризація пептидних зв'язків проліну каталізуються специфічними ензимами.

Основні терміни

Жирним шрифтом виділено терміни, значення яких наведено у словнику

Конформація

Нативна конформація

сольватний шар

пептидна група

діаграма Рамачандрана

Вторинна структура

α-спіраль

β-конформація

β-складка

β- поворот

Третинна структура

Четвертинна структура

фібрилярні протеїни

Надвторинна структура

Мотив

Згортка

Домен

родина протеїнів

мультимер

Оліґомер

Протомер

симетрія

Денатурація

розплавлена ґлобула

молекулярний шаперон

Hsp70

шапероніни

пріон

Завдання

1.  Властивості пептидного зв'язку. Під час рентґеноструктурного дослідження кристалів пептидів Лайнус Полінґ і Роберт Корі встановили, що зв'язок С-N у пептидах має довжину 1,32 Å, це значення є проміжним між типовими величинами довжин одинарних С-N (1,49 Å) і подвійних С=N (1,27 Å) зв'язків. Вони також знайшли, що пептидний зв'язок плоский (всі чотири з'єднані з С-N атоми перебувають в одній площині) і що два зв'язані з С-N α-вуглецеві атоми завжди знаходяться в транс-положенні один до одного (тобто по різні боки пептидного зв'язку).

(а) Як пов’язана довжина зв'язку С-N в пептидах із його міцністю і порядком (тобто, він одинарний, подвійний чи потрійний)?

(б) Які висновки шодо можливості обертання навколо пептидного зв'язку С-N можна зробити на підставі спостережень Полінґа і Корі?

2.  Співвідношення між структурою і властивостями фібрилярних протеїнів.За допомогою рентґеноструктурного аналізу шерсті Вільям Астбері встановив наявність структурної одиниці розміром 5,2 Å, яка повторюється вздовж волокна. Після обробки водяною парою і розтягнення волокна, на рентґенограмі було виявлено нову періодичну структурну одиницю розміром 7,0 Å. Якщо шерсть обробити парою, розтягнути, а потім дати їй збігтися, то на рентґенограмі знову буде видно вихідну структуру розміром близько 5,2 Å. Ці спостереження дали важливий ключ до розуміння молекулярної структури шерсті, проте в той час Астбері не зміг їх пояснити.

(а) Поясніть отримані Астбері результати на підставі сучасного розуміння структури шерсті.

(б) Коли шерстяний светр або шкарпетки випрати в гарячій воді чи висушити гарячим повітрям, вони збігаються. Шовкові тканини після такої ж обробки не змінюються. Поясніть, чому.

3. Швидкість синтезу α-кератину волосся. Волосся росте зі швидкістю 15 - 20 см на рік. Процес росту відбувається в основі волосини, де всередині живих клітин епідермісу філаменти α-кератину синтезуються і з'єднуються у канатоподібні структури (див. Рис. 4-11). Основним структурним елементом α-кератину є α-спіраль, яка містить 3,6 амінокислотних залишки на один виток завдовжки 5,4 Å (див. Рис. 4-4б). Приймемо, що синтез α-спіральних ланцюгів кератину є лімітуючим фактором швидкості росту волосся. Обчисліть швидкість синтезу пептидних звязків в α-кератинових ланцюгах (виражену у кількості пептидних зв'язків, утворених за секунду) на основі даних про річну швидкість росту волосся.

4.  Вплив рН на конформацію α-спіральних вторинних структур. Розгортання α-спіралі поліпептида у неупорядковану спіралізовану структуру супроводжується суттєвим зменшенням величини питомого обертання, яке вимірюється здатністю розчину повертати плоскополяризоване світло. Поліглутамат, поліпептид із залишків L-Glu, за рН 3 має конформацію α-спіралі. У разі зростання значення рН до 7 відбувається значне зменшення величини питомого обертання. Подібним же чином полілізин (полімер із залишків L-Lys) утворює α-спіраль за рН 10, але у разі зменшенні рН до 7 також спостерігається зменшення питомого обертання, як це видно з графіка:

(графік) збоку - Питоме обертання

α-Спіраль Полі(Glu) α-Спіраль Неупорядкована конформація Полі(Lys)    Неупорядкована конформація

Як можна пояснити вплив зміни рН на конформації полі(Glu) і полі(Lys)? Чому перехід відбувається в такому вузькому інтервалі рН?

5.  Дисульфідні зв'язки визначають властивості багатьох протеїнів. Деякі природні протеїни містятъ значну кількість дисульфідних зв'язків, причому їхні механічні властивості (міцність, в'язкість. твердість і т.д.) корелюють із вмістом цих зв'язків. Наприклад, глютенін, протеїн зерна пшениці зі значним вмістом дисульфідних зв'язків, забезпечує пружність і еластичність пшеничного тіста. Аналоґічно твердість і міцність панцира черепахи зумовлена великою кількістю дисульфідних зв'язків в його α-кератині.

(a) Яка молекулярна основа кореляції між вмістом дисульфідних зв'язків і механічними властивостями протеїну?

(б) Більшість ґлобулярних протеїнів денатурується і втрачає свої властивості при нетривалому нагріванні до 65^оС. Однак денатурацію ґлобулярних протеїнів з численними дисульфідними зв'язками потрібно провадити довше і за вищої температури. Один з таких протеїнів - інгібітор трипсину з підшлункової залози бика -  складається із одного ланцюга, що містить 58 амінокислотних залишків і три дисульфідні зв'язки. Під час охолодження розчину денатурованого протеїну його активність відновлюється. Яке молекулярне підґрунтя цієї властивості?

6.  Амінокислотна послідовність і структура протеїнів. Сучасне розуміння механізму згортання протеїнів дозволяє дослідникам робити припущення щодо їх структури на підставі даних про первинну амінокислотну послідовність.

(формула)

(а) Де ви передбачаєте існування згинів чи β-поворотів у наведеній вище послідовності?

(б) Де можуть утворюватися міжланцюгові дисульфідні поперечні зв'язки?

(в) Вважаючи, що ця послідовність складає частину більшого ґлобулярного протеїну, визначте можливе розміщення (на зовнішній поверхні чи всередині протеїну) таких амінокислотних залишків: Asp, Ile, Thr, Ala, Gln, Lys. Поясніть свою арґументацію. (Підказка: гідропатичні індекси наведено в Табл. 3-1).

7. Бактеріородопсин у пурпурних протеїнах мембран. За сприятливих умов солелюбива бактерія Halobacterium halobium синтезує мембранний протеїн бактеріородопсин (М_r 26 000), який має пурпуровий колір завдяки вмісту ретиналю (див. Рис. 10-21). Молекули цього протеїну об'єднуються в мембрані клітини у "пурпурові плями". Бактеріородопсин є світлочутливою протонною помпою, яка забезпечує клітину енерґією. Рентґеноструктурний аналіз цього протеїну показує наявність семи паралельних α-спіральних сеґментів, кожний з яких пронизує мембрану бактеріальної клітини (товщина 45 Å). Обчисліть мінімальне число амінокислотних залишків, необхідних для того, щоб один сеґмент α-спіралі повністю пройшов крізь мембрану. Оцініть, яка частина бактеріородопсину припадає на спіралі, що пронизують мембрану (використайте значення ваги середнього амінокислотного залишку, яке дорівнює 110).

8.  Патоґенна дія бактерій, що спричиняють газову ґанґрену. Високопатоґенна анаеробна бактерія Clostridium perfringens викликає газову ґанґрену, при якій руйнується структура тканини тварин. Бактерія виділяє ензим, який ефективно каталізує гідроліз пептидних зв'язків, позначених червоним кольором:

(рівняння)

де Х і Y - будь-яка з 20 стандартних амінокислот. Яким чином виділення цього ензиму бактерією забезпечує її проникнення в тканини людини? Чому цей ензим не впливає на бактерію?

9.  Число поліпептидних ланцюгів у мультисубодиничному протеїні. Зразок (660 мг) оліґомерного протеїну з М_r 132 000 було оброблено надлишком 1-фтор-2,4-динітробензолу (реаґент Сенджера) у м'яких лужних умовах до повного завершення хімічної реакції. Після цього пептидні зв'язки протеїну були повністю гідролізовані нагріванням з концентрованою HCl. Гідролізат містив 5,5 мг такої сполуки:

(формула)

2,4-динітрофенільні похідні α-аміногруп інших амінокислот знайдені не були.

(a) Поясніть, яким чином можна використати цю інформацію для визначення кількості поліпептидних ланцюгів в оліґомерному протеїні.

(б) Обчисліть кількість поліпептидних ланцюгів у цьому протеїні.

(в) Який інший метод аналізу протеїнів можна застосувати для визначення того, однакові чи різні поліпептидні ланцюги входять до складу даного протеїна?

Біохімія в інтернеті

10. Моделювання протеїнів за допомогою інтернету. Для визначення причини хвороби Крона (запалення нутрощів) групі пацієнтів була проведена біопсія слизової оболонки кишковика. У результаті було виявлено протеїн, що має вищу експресію у пацієнтів з хворобою Крона, ніж у пацієнтів з іншими видами запалень та здорових людей. Протеїн виділили і встановили наступні амінокислотні послідовності його фраґментів (читати зліва направо)

(послідовності)

(а) Ідентифікуйте цей протеїн за базами даних в інтернеті. Починати варто з Proteіn Information Resource (PIR; pir.georgetown.edu/pirwww), Structural Classification of Proteins (SCOP, http://scop.berkeley.edu та Prosite (http://us.expasy.org/prosite).

На вибраній вами інтернетній сторінці знайдіть проґрами для порівняння послідовностей (sequence comparison engine). Введіть близько 30 залишків з послідовності протеїну у вікно пошуку і почніть аналіз. Які результати ви отримаєте щодо природи протеїну?

(б) Використайте різні відрізки амінокислотної послідовності. Чи завжди результат буде той самий?

(в) Деякі веб-сторінки надають інформацію про тривимірну структуру протеїнів. Знайдіть дані про вторинну, третинну і четвертинну структури протеїну, використовуючи дані Protein Data Bank (PDB, www.rcsb.org/pdb) або SCOP.

(г) У процесі пошуку спробуйте знайти інформацію про функцію цього протеїну у клітині.

РИС. 4-1 Структура ґлобулярного протеїна - ензима хімотрипсину.Протеїни - це великі молекули, кожна з яких, як ми побачимо в подальшому, має свою унікальну структуру. Для уявлення про розмір молекул протеїнів на рисунку справа наведено зображення молекули амінокислоти ґліцину (блакитного кольору). Визначені тривимірні структури протеїнів занесено до Протеїнового Банку Даних (PDB - Protein Data Bank, www.rcsb.org/pdb). Кожній структурі приписано ідентифікаційний номер з чотирьох знаків, або PDB ID. Де це можливо, ми наводитимемо значення PDB ІD для молекулярних графічних зображень у підписах до рисунків. Наведене тут зображення було отримано з використанням даних з PDB, файл 6GCH. Дані файлів PDB містять лише набір координат щодо розташування атомів і їх зв'язків між собою. Для отримання зображень використовують нескладні у використанні графічні проґрами типу RasMol і Chime, котрі перетворюють координати в зображення і дозволяють оперувати структурою у трьох вимірах. Інструкції для завантаження Chime разом із програмою навчання наведено на інтернетній сторінці цієї книги (www.whfreeman.com/lehninger). Веб-сторінка PDB містить також інструкції для завантаження інших проґрам зображення протеїнів. Ми радимо всім студентам скористатися даними PDB і безкоштовними програмами молекулярної графіки.

РИС. 4-2 Плоска пептидна група. (а)Кожний пептидний зв'язок  частково має характер подвійного зв’язка завдяки наявності резонансу і неможливості вільного обертання. (б) Три зв'язки, що розділяють сусідні α-вуглеці поліпептидного ланцюга. Навколо зв'язків N-С_α і С_α-С обертання можливе; кути їх зв'язків позначають відповідно φ і ψ. Вільне обертання навколо пептидного зв'язку С-N неможливе. Обертання навколо інших одинарних зв'язків пептидного каркасу також може мати обмеження, викликані розміром і зарядом їхніх R-груп. У наведеній конформації φ і ψ дорівнюють 180^о (або -180^о). Якщо дивитися від α-вуглецю, то кути φ і ψ збільшуються по мірі обертання карбонілу чи атомів амідного азоту (відповідно) за годинниковою стрілкою. (в) Прийнято, що значення кутів φ і ψ дорівнюють 0^о у тому випадку, коли два пептидних звязки з обох боків α-вуглецю знаходяться в одній площині і розташовані, як це наведено на рисунку. У протеїні ця конформація неможлива внаслідок просторового перекривання атомів α-карбонільного кисню і α-амінного водню. Щоб проілюструвати зв'язки між атомами, розмір кульок, які позначають кожен атом, зменшено порівняно з реальними радіусами ван дер Ваальса. 1 Å = 0.1 нм.

 (а) Карбонільний кисень має частково неґативний заряд, а амідний азот - частково позитивний заряд, внаслідок чого виникає невеликий електричний диполь. Практично всі пептидні зв'язки в протеїнах мають зображену тут транс-конфіґурацію; виняток наведено на Рис. 4-8б.

(б) Амінний кінець            Карбоксильний кінець

РИС. 4-3 Діаграма Рамачандрана для залишків L-Ala. Конформація пептидів визначається величинами кутів φ і ψ. Можливими вважаються ті конформації, що мають незначну або нульову стеричну інтерференцію, яка може бути розрахована на основі значень радіусів ван дер Ваальса і кутів між зв'язками. Синім кольором відмічено конформації без стеричного перекривання, тому вони повністю можливі; блакитним - конформації, можливі на межі дозволених контактів між атомами; світло-блакитним – конформації, можливі за малих відхиленнь значень кутів. Асиметрія діаграми відображає L-стереохімію амінокислотних залишків. Приблизно такими ж є діаграми для залишків інших L-амінокислот з нерозгалуженими бічними ланцюгами. Дозволені межі для залишків розгалужених амінокислот, таких як Val, Ile і Thr дещо менші, порівняно з Ala. Набагато ширший діапазон можливих конформацій характерний для залишку Gly, який має менше стеричних обмежень. У той же час для залишку Pro існує набагато більше обмежень, оскільки циклічна структура його бічного ланцюга дозволяє значення φ лише в діапазоні від -35^о до -85^о.

ψ (градуси)              φ (градуси) 

РИС. 4-4 Чотири моделі α-спіралі, які відображають різні аспекти її структури. (а) Утворення правозакрученої α-спіралі. Площини жорстких пептидних зв'язків паралельні довгій осі спіралі, зображеній тут у вигляді вертикального стрижня. (б) Кульково-стрижнева модель правозакрученої α-спіралі, яка демонструє внутрішньоланцюгові водневі зв'язки. Повторюваною одиницею є один виток спіралі, що охоплює 3,6 залишків. (в)Зображення α-спіралі з торця, якщо дивитися вздовж довгої осі (отримано з PDB ID 4TNC). Зауважте положення R-груп, позначених фіолетовими кульками. Кульково-стрижнева модель, що використовується для зображення спіральної конфігурації, на перший погляд дає неправильне уявлення, ніби спіраль порожня всередині, оскільки розміри кульок не відповідають радіусам ван-дер-Ваальса окремих атомів. Зображення просторової моделі (г)свідчить, що насправді атоми всередині α-спіралі розташовані дуже щільно.

Амінний кінець Карбоксильний кінець     у рамці: Вуглець     Водень    Кисень  Азот R-група

3.6 залишків

РИС. 4-5. Взаємодії між R-групами амінокислот, розташованих в α-спіралі на відстані трьох залишків. Просторова модель (отримана з PDB ID 4TNC) демонструє міжіонну взаємодію залишків Asp¹⁰⁰ і Arg¹⁰³ в α-спіральній ділянці кальцій-зв'язувального протеїну м'язів тропоніну С. Поліпептидний каркас (атоми вуглецю, α-амінного азоту і α-карбонільного кисню) сеґмента спіралі завдовжки 13 залишків забарвлено сірим кольором. Наведено лише бічні ланцюги Asp (червоний) і Arg (синій), які взаємодіють між собою.

РИС. 4-6 Диполь спіралі. Електричний диполь пептидного зв'язку (див. Рис. 4-2а) передається вздовж α-спірального сеґмента через внутрішньоланцюгові водневі зв'язки, зумовлюючи диполь спіралі. На цьому рисунку аміно- і карбонільні складові кожного пептидного зв'язку позначено відповідно як + і -. Незв'язані водневими зв'язками аміно- і карбонільні групи пептидних зв’язків на кінцях α-спіральної ділянки позначено червоним.

Амінний кінець        Карбоксильний кінець

РИС. 4-7 β-Конформація поліпептидних ланцюгів.Наведений вигляд зверху і збоку показує розташування R-груп, які виступають із β-складки, і підкреслює складчасту форму, утворену площинами пептидних зв'язків (Альтернативна назва цієї структури - β-складчастий шар). Показано також перехресні водневі зв'язки між сусідніми ланцюгами. (а)Антипаралельна β-складка, для якої характерна протилежна орієнтація амінокінців по відношенню до карбоксильних кінців у сусідніх ланцюгах (показано стрілками). (б) Паралельна β-складка.

(а) Антипаралельна          Вигляд зверху        Вигляд збоку

(б) Параллельна               Вигляд зверху        Вигляд збоку

РИС. 4-8 Структури β-поворотів. (а)Найпоширеніші повороти типу І і ІІ; тип І зустрічаються вдвічі частіше, ніж тип ІІ. У поворотах типу ІІ третім залишком завжди є Gly. Зауважте існування в обох типах водневого зв'язку між пептидними групами першого і четвертого залишків згину. (Залишки амінокислот оточені великими блакитними колами). (б)Транс- і цис-ізомери пептидного зв'язку за участю імінного азоту залишку проліну. Окрім проліну, пептидні зв'язки між всіма іншими амінокислотними залишками у понад 99,5% випадків мають транс-конфіґурацію. Близько 6% пептидних зв'язків, що включають імінний азот проліну, знаходяться у цис-конфіґурації, яка досить часто зустрічається саме в β-поворотах.

(а) β-поворот           Тип І     Гліцин   Тип ІІ

(б) Ізомери проліна          транс              цис

РИС. 4-9 Діаграми Рамачандрана для різних структур. (а) Значення φ і ψ для різних дозволених вторинних структур накладені на діаграму з Рис. 4-3. Хоча теоретично можливі і лівозакручені α-спіралі, що охоплюють кілька амінокислотних залишків, проте в протеїнах їх не знайдено. (б) На діаграму теоретично дозволених конформацій (Рис. 4-3) накладено значення φ і ψ для залишків всіх амінокислот, за винятком Gly, що входять до складу ензима піруваткінази (виділеної із кроля). Малі гнучкі залишки Gly виключені з розгляду, оскільки вони часто виявляються поза межами дозволених конформацій (позначено блакитним).

Антипаралельні β-складки Паралельні β-скадки Потрійна спіраль колаґена

Правозакручені β-складки

Лівозакручена α-спіраль

Правозакручена α-спіраль

градуси – 4 рази

РИС. 4-10 Відносна ймовірність локалізації певної амінокислоти в одному з трьох поширених типів вторинної структури.

α-Спіраль β-Конформація β-поворот.

РИС. 4-11 Структура волосини. (а) α-Кератин волосся - це видовжена α-спіраль з потовщеннями поблизу амінокінця і карбоксикінця молекули. Пари цих спіралей закручуються одна навколо іншої вліво з утворенням дволанцюгових скручених спіралей. Далі ці елементи служать основою структур вищого порядку - протофіламентів і протофібрил. Приблизно чотири протофібрили - разом 32 нитки α-кератину - об'єднуються з утворенням проміжного філаменту. Окремі дволанцюгові скручені спіралі також, очевидно, перебувають у взаємно скрученному стані у різних субструктурах, однак напрямок їхнього скручування та інші структурні деталі не з’ясовано. (б) Волосина складається із багатьох філаментів α-кератину, субструктура яких наведена в (a).

(а)α-Спіраль кератину    Дволанцюгова скручена спіраль       Протофіламент

Протофібрила

(б) Поперечний зріз волосини

Клітини Проміжний філамент Протофібрила Протофіламент  

Дволанцюгова скручена спіраль        α-Спіраль