Дифракція рентгенівських променів

Розташування атомів у кристалічній ґратці можна з’ясувати шляхом визначення положення і інтенсивності плям, утворених на фотоплівці пучком рентґенівських променів певної довжини хвилі після його дифракції електронами цих атомів. Наприклад, такий рентгеноструктурний аналіз кристалів хлориду натрію показує, що іони Na⁺ і Cl^- утворюють просту кубічну ґратку. Просторове розташування різних типів атомів у складних орґанічних молекулах, навіть у таких великих, як протеїни, також можна проаналізувати методом дифракції рентгенівських променів. Проте аналіз структури складних молекул набагато трудомісткіший, ніж простих кристалів солі. Якщо повторюваною одиницею кристалу є така велика молекула, як протеїн, то її численні атоми породжують тисячі дифракційних плям, котрі необхідно аналізувати за допомогою комп'ютера.

Принцип цього процесу можна зрозуміти, розглядаючи виникнення зображення у світловому мікроскопі. Світло з точкового джерела фокусується на об'єкті. Хвилі світла розсіюються об'єктом, а потім збираються набором лінз, утворюючи його збільшене зображення. Розмір об'єкта, структура якого може бути визначена за допомогою такої системи, залежить від роздільної здатності мікроскопа, яка визначається довжиною хвилі світла, - у даному випадку видимого світла з довжиною хвиль від 400 до 700 нм. Не можна розрізнити об'єкти, розміри яких менші, ніж половина довжини хвилі світла. Для розрізнення настільки малих об'єктів, як протеїни, необхідно застосовувати рентґенівські промені з довжиною хвиль в інтервалі від 0,7 до 1,5 Å (0,07 - 0,15 нм). Однак немає лінз, здатних збирати рентґенівське випромінювання з утворенням зображення; тому набір дифраґованих променів реєструється безпосередньо, а зображення реконструюється за допомогою математичних методів.

Об'єм інформації, одержаної із застосуванням рентґенівської кристалоґрафії, залежить від ступеня структурної впорядкованості зразка. Деякі важливі структурні параметри були встановлені у ранніх дослідженнях дифракційної картини фібрилярних протеїнів, упорядкованих у строго регулярний спосіб у шерсті та волоссі. Однак упорядковані пучки фібрилярних протеїнів не є кристалами – їхні молекули розташовані поруч, але не всі вони орієнтовані в одному напрямку. Для отримання детальнішої інформації щодо тривимірної структури необхідні високовпорядковані кристали молекул протеїнів. Однак їх кристалізація - це до певної міри емпіричний процес, і структури багатьох важливих протеїнів досі невідомі просто тому, що їх дуже складно закристалізувати. Експериментатори порівнюють створення кристалів протеїнів з процесом утримування разом безлічі м’ячів для боулінга (гри в кулі) за допомогою целофанової стрічки.

На практиці структурний аналіз із застосуванням рентгенівських променів включає декілька етапів (Рис. 1). Отриманий кристал розміщують між джерелом випромінювання та детектором, при цьому генерується регулярний набір плям, які називають рефлексами. Їх утворює дифраґований рентгенівський промінь, і кожен атом у молекулі робить свій внесок до кожної плями. Карту розподілу електронної густини протеїну реконструюють на підставі загальної дифракційної картини плям за допомогою математичного методу, названого перетворенням Фур'є. Фактично комп'ютер у цьому випадку виступає як "обчислювальна лінза". Далі на основі карти розподілу електронної густини будують модель структури.

Джон Кендрю виявив, що картина дифракції рентгенівських променів кристалічного міоґлобіну (виділеного з м'язів кашалота) дуже складна і включає близько 25000 рефлексів. Комп'ютерний аналіз їх проходив у кілька етапів. На кожному етапі розрізнення структури протеїнів підвищувалося, аж доки в 1959 р. не було визначено положення практично всіх неводневих атомів. Амінокислотна послідовність, отримана шляхом хімічного аналізу, співпала з молекулярною моделлю. З того часу подібним способом встановлено структури тисяч протеїнів, багато з яких значно складніші від міоґлобіну.

Звичайно, протеїн у кристалічній формі перебуває в оточенні, відмінному від розчину чи живої клітини. Окрім того, метод дифракції рентгенівських променів дає усереднене уявлення про структуру кристалу в часі та просторі, і недостатньо інформує про молекулярний рух всередині протеїну. У принципі на конформацію протеїну в кристалі можуть також впливати нефізіолоґічні фактори, такі як випадкові контакти між молекулами протеїнів всередині кристалу. Проте співставлення даних, отриманих при дослідженні кристалів, та іншими методами (такими, як описаний далі метод ЯМР) показує, що структура протеїнів, визначена на підставі аналізу кристалів, практично завжди відображає їхню функціональну конформацію. Окрім того, метод рентґенівської кристалографії можна успішно використовувати для вивчення великих протеїнів, які не піддаються аналізу методом ЯМР.

Рисунок 1.

Етапи визначення структури міоґлобіну кашалота методом рентґенівської кристалографії. (а) Отримання дифракційної картини кристала протеїну. (б) Дані дифракційного аналізу використовують для обчислення тривимірної карти розподілу електронної густини протеїну. Тут наведено електронну густину тільки частини структури - гема (в) Ділянки з найбільшою електронною густиною відповідають положенням ядер атомів, і ця інформація використовується для визначення остаточної структури. На рисунку структура гема змодельована на карті її електронної густини. (г) Повна структура міоґлобіну кашалота разом з гемом. (PDB ID 2MBW).

Ядерний маґнітний резонанс

Важливим допоміжним методом визначення тривимірної структури макромолекул є ядерний маґнітний резонанс (ЯМР). Сучасні методики його застосуванням дозволяють визначати структури великих молекул, зокрема вуглеводів, нуклеїнових кислот і протеїнів малого та середнього розміру. Значна перевага методу ЯМР полягає у можливості дослідження молекул у розчині, тоді як застосування рентґенівської кристалоґрафії обмежене лише здатними до кристалізації молекулами. Він також може надати інформацію про динамічні аспекти структури протеїнів, включаючи конформаційні зміни, згортання протеїнів та їхню взаємодію з іншими молекулами.

ЯМР є одним з проявів квантово-механічних властивостей атомного ядра, а саме його спінового кутового моменту. Лише певні атоми, зокрема ¹Н, ¹³С, ¹⁵N, ¹⁹F і ³¹Р, мають тип ядерного спіну, придатний для отримання ЯМР-сиґналу. Ядерний спін ґенерує маґнітний диполь. Якщо на розчин макромолекул одного типу подіяти сильним постійним маґнітним полем, то маґнітні диполі розташовуються в ньому в одній із двох орієнтацій - паралельній (низька енерґія) або антипаралельній (висока енерґія). Далі під прямими кутами до орієнтованих у маґнітному полі ядер подають короткий (~10 μсек) імпульс електромаґнітної енерґії відповідної частоти (резонансної частоти, яка знаходиться в діапазоні радіочастот). Певна частина енерґії поглинається внаслідок переходу ядер на вищий енергетичний рівень, а утворений спектр поглинання містить інформацію про природу ядер і їх найближче хімічне оточення. Результати великої кількості таких експериментів із певним зразком усереднюють, що збільшує відношення сиґналу до шуму, і отримують ЯМР-спектр, подібний до зображеного на рисунку 2.

Завдяки високій чутливості і поширенню, особливо важливе значення для проведення експериментів із застосуванням ЯМР має атом водню, ¹Н. ¹Н–ЯМР-спектри макромолекул можуть бути дуже складними.. Навіть невеликі протеїни мають сотні ¹Н-атомів, внаслідок чого одновимірний ЯМР-спектр стає складним для аналізу. Структурний аналіз протеїнів став можливим з розвитком методів двовимірного ЯМР (Рис. 3). Вони дозволяють виміряти залежне від відстані спряження ядерних спінів у сусідніх атомів (т.зв. nuclear Overhauser effect – NOE, метод названо NOESY, закінчення  sy від анг. spectroscopy), чи спряження ядерних спінів атомів, з'єднаних ковалентними зв'язками (метод TOCSY, від анг. - total correlation spectroscopy, тобто загальна корелятивна спектроскопія).

Визначення повної тривимірної структури на підставі двовимірного ЯМР-спектра може бути досить трудомістким процесом. Сиґнали NOE надають певну інформацію про відстані між окремими атомами, але для її використання необхідно спершу ідентифікувати ці атоми. Додатковіексперименти із застосуванням методу загальної корелятивної спектроскопії допомагають визначити, які з NOE-сиґналів відповідають ковалентно зв'язаним атомам. Певні типи цих сиґналів співвідносяться із вторинними структурами, такими як α-спіралі. Сучасну ґенетичну інженерію (Розділ 29) можна використати для конструювання протеїнів, які містять нестандартні ізотопи ¹³С та ¹⁵N. Нові ЯМР-сигнали від цих атомів і їх спряження із ¹Н-сигналами, що виникають у разі таких заміщень, допомагають ідентифікувати окремі ¹Н-NOE-сиґнали. Сприяє цьому процесу і знання амінокислотної послідовності протеїнів.

Для визначення тривимірної структури дані про відстані між атомами завантажують у комп'ютер разом з відомими ґеометричними даними про хіральність, радіуси ван дер Ваальса, довжини зв'язків та значення кутів. За допомогою комп’ютерної обробки отримують групу близьких структур, якій властивий діапазон конформацій, сумісних з даним набором NOE-відстаней (Рис. 3в). Неточності визначення структури методом ЯМР частково пов'язані з молекулярними вібраціями ("диханням") всередині структури протеїну у розчині, що більш детально розглянуто в розділі 5. Певну роль може відігравати також звичайна похибка експерименту

Дані про структуру протеїну, визначену обома методами – рентґенівської кристалографії і ЯМР ‑ загалом добре узгоджуються. У деяких випадках відрізняється розташування бічних ланцюгів певних амінокислот, часто внаслідок ефектів, пов'язаних з упаковкою сусідніх молекул протеїнів у кристалах. Разом ці два методи забезпечують швидке зростання кількості інформації про структуру макромолекул живих клітин.

Рисунок 2

Одновимірний ЯМР-спектр ґлобіну морського кров’яного черв’яка. Цей протеїн – близький структурний аналог міоґлобіна кашалота, належитъ до тієї ж структурної родини протеїнів і виконує функцію перенесення кисню.

Хімічне зміщення ¹Н (ppm)

Рисунок 3

Використання двовимірного ЯМР для визначення тривимірної структури ґлобіну, спектр якого наведено на Рис. 2. Діаґональ на двовимірному спектрі відповідає одновимірному спектру. Піки, що знаходяться поза діагоналлю, - це сиґнали NOE, що виникли внаслідок близьких взаємодій ¹Н-атомів, і які можуть генерувати сигнали, розташовані досить віддалено на одновимірному спектрі. Дві такі взаємодії наведено на рисунку (а), їх положення в молекулі зображено синіми лініями (б,PDB ID 1VRF). Три лінії позначають взаємодію 2 між метильною групою протеїну і воднем гему. Метильна група швидко обертається, так що кожен з її трьох атомів робить однаковий внесок до взаємодії і ЯМР-сиґналу. Ця інформація була використана для визначення повної тривимірної структури (PDB ID 1VRE, рис. 3в). Численні лінії, що зображають каркас молекули протеїну, репрезентують родину структур, які відповідають відстаням між атомами, визначеними з даних ЯМР. Добре видно структурну подібність до міоґлобіну (Рис. 1). На обох рисунках протеїни орієнтовані однаково.

Хімічне зміщення ¹Н (ppm) Хімічне зміщення ¹Н (ppm)