Методы лабораторной диагностики, применяемые в иммунологии

4.1 Методы, используемые для определения клеточных показателей иммунитета (количественные методы)

4.1.1. Определение клеточных маркеров методом розеткообразования

4.1.2 Определение клеточных маркеров методом мембранной иммунофлюоресценции

Принцип метода. Мембранная иммунофлуоресценция (МИФ) используется для локализации антигена (АГ) на интактной мембране. Для визуализации применяют специфические антитела (АТ), мечнные (конъюгированные) красителем, флуоресцирующим при облучении светом с адекватной длиной волны.

Разновидности метода:

- прямая МИФ – флуорохромные АТ связываются непосредственно с мембранными антигенами;

- непрямая МИФ (метод двойных антител) – на первом этапе с мембранными АГ связываются специфические немеченые АТ, на втором этапе с АТ связываются флуорохромные антивидовые АТ. Например антитела к g-глобулину кролика, если первые АТ были получены иммунизацией кроликов;

-непрямая МИФ, оба АТ флуорохромированы.

Способы учета результата МИФ:

1 Метод флюоресцентной микроскопии

2 Метод проточной цитофлуориметрии

4.1.3 Определение клеточных маркеров методом магнитной сепарации

Принцип метода.Методика определения уровня содержания в крови абсолютного количества лейкоцитов (популяций и субпопуляций лимфоцитов) основана на добавлении к образцу цельной крови частиц Dynabeads – моноклональных антител к необходимому лейкоцитарному антигену, иммуномагнитном выделении лейкоцитов из цельной крови, лизировании клеток, окрашивании выделенных ядер генцианвиолетом и подсчете окрашенных ядер на световом микроскопе.

Существуют два возможных варианта метода магнитной сепарации: негативное и позитивное выделение клеток.

4.1.3 Определение клеточных маркеров с использованием метода розеткообразования (Е-РОК и ЕАС-РОК)

Принцип метода Е-розеток. Т-лимфоциты обладают свойством образовывать розетки с эритроцитами барана. Рецептор эритроцитов барана рассматривают как маркер тимусзависимых лимфоцитов (Е-РОК: Erythrocyte — розеткообразующие клетки).

Принцип метода ЕАС-розеток. В-лимфоциты обладают свойством образовывать розетки с эритроцитами мыши. Метод ЕАС-розеток предназначен для выявления рецепторов к комплементу на поверхности мононуклеаров (лимфоциты, моноциты). Эритроциты, сенсибилизированные амборецептором антиэритроцитаркной сыворотки и нагруженные комплементом, связываются с мембраной мононуклеаров, содержащих рецепторы комплемента, с образованием розеток. Количество лимфоцитов, образующих ЕАС-розетки, частично коррелирует с количеством лимфоцитов, на поверхности которых обнаруживаются мембранные иммуноглобулины, то есть преимущественно с В-лимфоцитами.

За розетку принимают лимфоцит, окруженный тремя и более эритроцитами. Лимфоцит полностью окруженный эритроцитами, называется морулой.

4.2 Методы, используемые для определения клеточных показателей иммунитета (функциональные тесты)

4.2.1 Реакция бласттрансформации лимфоцитов

Принцип метода. Активация лимфоцитов под действием антигенов (митогенов), в результате чего наступает бласттрансформация клеток. Для стимуляции Т- и В-лимфоцитов используют различные митогены. Например, для стимуляции Т-лимфоцитов применяют ФГА и КонА и др., В-лимфоцитов – протеин А и др.

Под микроскопом в иммерсионной системе оценивают размеры лимфоцитов:

- малые лимфоциты (d клеток 7-7,5 мкм);

- бластоподобные переходные формы (d клеток 8-14 мкм);

- бласты (d клеток более 14 мкм).

4.2.2 Методика определения провокационных и кожных проб с предполагаемыми аллергенами.

Принцип метода. Метод основан на особенностях организма человека, заболевшего или переболевшего определенным инфекционным заболеванием (туляремией, бруцеллезом, туберкулезом и т.д.) отвечать местной аллергической реакцией, в виде гиперемии и инфильтрата, на введение спецефического антигена (тулярина, бруцеллина, туберкулина и т.д.).

Результат реакции оценивается через 48-72 часа (в соответствии с инструкцией по применению аллергена) путем измерения размера инфильтрата (папулы) в мм. Гиперемию учитывают только в случае отсутствия инфильтрата. Линейкой измеряют поперечный по отношению к предплечью размер инфильтрата.

При постановке реакции, например Манту, учет проводят следующим образом:

- отрицательная реакция – при полном отсутствии инфильтрата (папулы) и гиперемии или при наличии уколочной реакции (0-1 мм);

- сомнительная реакция – при инфильтрате размером 2-4 мм или только гиперемии любого размера без инфильтрата;

- положительная реакция – при наличии инфильтрата диаметром 5 мм и более;

- гиперергическая реакция – у детей и подростков считается реакция с диаметром инфильтрата 17 мм и более, у взрослых 21 мм и более, а также визикулонекротические реакции независимо от размера инфильтрации с лимфангоитом или без него.

К методам, используемым для определения функционального состояния клеток, относятся также цитотоксический тест, методы определения уровня продукции клетками цитокинов, интерферонов.

4.3 Методы, используемые для определения клеток, участвующих в реакции фагоцитоза

Скрининговые методы:

1 Оценка общего числа нейтрофилов (подсчет клеток с использованием метода микроскопии, геманализатора).

2 Исследование интенсивности поглощения микробов фагоцитами

(процент клеток-фагоцитов и средняя способность к поглащению каждого фагоцита) – ФАН.

3 Бактерицидность фагоцитов по НСТ-тесту.

Уточняющие методы:

1 Интенсивность хемотаксиса (миграции) фагоцитов.

2 Исследование адгезивной способности нейтрофилов к пластику и оценка числа клеток с адгезивными молекулами CD11/CD18 на мембране.

3 Реакция торможения миграции лейкоцитов.

Принцип метода определения ФАН. Определение фагоцитарной активности нейтрофилов основано на способности нейтрофилов поглощать и переваривать чужеродные частицы.

Оценку результатов исследований проводят методом микроскопии под иммерсией. Поглотительную способность клеток оценивают по двум показателям:

1 Фагоцитарному индексу Гамбургера – проценту фагоцитов, имеющих поглощённые частицы, от общего числа лейкоцитов;

ИФ = , где

ИФ – индекс фагоцитоза;

n – число фагоцитировавших нейтрофилов;

х – число фагоцитированных частиц;

N – общее число просчитанных нейтрофилов

2 Фагоцитарному числу Райта (ФЧ) – среднему числу фагоцитированных частиц на один фагоцит.

Принцип метода НСТ. Основан на способности нейтрофилов поглощать нитросиний тетразолий и восстанавливать его в гранулы синего цвета нерастворимого диформазана. Восстановление НСТ обеспечивается энергией и продуктами окислительно-восстановительных реакций «метаболического взрыва, сопровождающих процесс фагоцитоза, а также повышением метаболизма активированного нейтрофила. Различают спонтанный и индуцированный НСТ-тест. Результаты спонтанного теста указывают на количество активированных клеток в крови больного. Результаты стимулированного теста дают представление о способности исследуемых нейтрофилов к активации in vitro.

Реакцию учитывали на световом микроскопе. Учёт результатов реакции проводят при подсчете 100 нейтрофилов. Вычисляют процент клеток, содержащих включения диформазана в виде гранул или сплошных отложений.

а) с нулевой активностью (гранул нет);

б) со слабо положительной реакцией (единичные гранулы);

с) с положительной реакцией (гранулы покрывают до 50% площади цитоплазмы);

д) с резко положительной реакцией (более 50% площади цитоплазмы занято гранулами).

Принцип метода оценки интенсивность хемотаксиса (миграции) фагоцитов. Лейкоциты обладают способностью направлено перемещаться под действием хемотаксического раздражения in vitro. В отсутствии такого раздражения лейкоциты движутся беспорядочно. Наличие такого раздражения приводит к тому, что они начинают перемещаться в одном направлении под влиянием веществ, вызывающих хемотаксис. Хемотоксическое ориентирование происходит под воздействием градиента концентрации. От хемотаксиса следует отличать усиленное, но ненаправленное движение клеток под влиянием некоторых веществ, содержащихся в окружающей среде. Хемотоксические факторы возникают in vitro при реакциях клеточного и гуморального иммунитета. Для изучения хемотаксиса Boyden предложил использовать микропористые фильтры. Метод основан на способности лейкоцитов проходить сквозь пористую мембрану в направлении градиента концентрации веществ, вызывающих хемотаксис.

Принцип метода оценки адгезивной способности нейтрофилов к пластику и оценка числа клеток с адгезивными молекулами CD11/CD18 на мембране. Под воздействием провоспалительных цитокинов меняются адгезивные свойства как фагоцитов, так и клеток эндотелия В процессе движения нейтрофилов по сосуду часть из них образуют пристеночный пул. Контакты нейтрофилов с клетками эндотелия опосредуются адгезионными молекулами, относящимися к семейству селектинов. На лейкоцитах они представлены L-селектинами, на эндотелиальных клетках – это P- и E-селектины. Под действием провоспалительных цитокинов клетки эндотелия и нейтрофилов экспрессируют на своей поверности еще один класс адгезионных молекул, относящихся к семейству интегринов. Они и обеспечивают фазу прочной адгезии нейтрофилов. На нейтрофилах экспрессируются β₂ интегрины, или CD11/CD18 рецепторы. Они представлены тремя адгезионными молекулами: CD11a/CD18, CD11b/CD18 и CD11c/CD18.

Принцип метода оценки реакции торможения миграции лейкоцитов.

Подвижность лейкоцитов периферической крови, их миграция к очагам тканевой деструкции, хемотаксис к ауто- и гетероантигенам, перераспределение между лимфоидными органами при стрессорно-адаптивных реакциях являются составляющей компонентой общей системы реактивности, способности к сохранению постоянства внутренней среды.

Сенсибилизированные к определенному антигену лимфоциты резко снижают скорость подвижности в среде, в которую вносят этот антиген. Реакция осуществляется при непосредственном взаимодействии антигенспецифических рецепторов лейкоцитов с антигеном, а также через воздействие фактора, ингибирующего миграцию клеток, выделяющегося при контакте со специфическим антигеном. Этот феномен позволяет продемонстрировать органоспецифическую клеточно-опосредованную гиперчувствительность.

Реакция торможения миграции лейкоцитов оценивают в агармиграционном и прямом капиллярном тесте.

4.4 Методы, используемые для определения гуморальных реакций иммунитета

4.4.1 Реакция гемагглютинации

Принцип метода. Гемаггютинация – обусловленное реакцией АГ-АТ видимое слипание эритроцитов.

Реакция ставиться в 96-луночных круглодонных полистероловых планшетах для РНГА.

Интенсивность реакции зависит от количества осаждённых эритроцитов на дне образованных лунок. Учет реакции агглютинации проводят следующим образом:

«-» – отрицательная, характеризуется осаждением эритроцитов на дно лунок в виде небольшого колечка с гладкими краями или «пуговки»;

«+» – слабая, характеризуется небольшими одиночными отложениями на дне лунки. Неагглютинированные эритроциты образовывают «маленькое колечко» в центре лунки;

«++» – средней интенсивности – на дне лунки образуется «широкое плотное кольцо» из неагглютинированных эритроцитов;

«+++» – интенсивная – агглютинированные эритроциты образуют так называемые «зонтики», в центре которых, явно видны кольца, образованные осевшими неагглютинированными эритроцитами;

«++++» – резко интенсивная, в которой агглютинируются все эритроциты и, образуя «зонтики», выстилают дно лунок.

 Титром данной реакции считают последнее разведение сыворотки, при котором выявляется явная агглютинация эритроцитов не менее «+++», то есть при интенсивной или резко интенсивной реакции.

4.4.2 Иммунодиффузия

Выделяют следующие разновидности иммунодиффузии:

- Простая одномерная и простая двухмерная радиальная.

- Двойная одномерная; двойная двухмерная радиальная и двойная двухмерная радиальная угловая.

Принцип метода. Иммунодиффузия основана на способности образования линий преципитации в геле при взаимодействии специфического АГ с АТ.

4.4.3 Иммуноферментный анализ (ИФА)

Принцип метода. АГ или АТ, вступающее в иммунную реакцию, метится ферментом. По превращению субстрата ферментом можно судить о количестве вступившего во взаимодействие компонента реакции АГ-АТ.

В качестве примера приведем схему «сендвич – ИФА» (метод двойных антител для определения антигена):

1 – сенсибилизация планшета АТ (АТ связываются с твердой фазой);

2 – отмывка;

3 – добавление АГ;

4 – инкубация с пробой, содержащей АГ;

5 – отмывка;

6 – добавление антивидовых антител, меченных пероксидазой хрена;

7 – инкубация с конъюгатом АТ – фермент;

8 – отмывка;

9 – инкубация с субстратно-индикаторной смесью и измерение количества продукта реакции: качественно (по изменению цвета) или количественно (на ИФА-анализаторе).

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1 Хаитов Р.М., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. – Иммунология. М.: Медицина, 2000. – 432 с.

2 Ярилин А.А. Основы иммунологии. – М.: Медицина, 1999. – 608 с.

3 Кульберг А.Я. Молекулярная иммунология. – М.: Высшая школа, 1985. – 287 с.

4 Ройт А., Дж. Брострофф, Д. Мейл. Иммунология. – М.: Мир, 2000. – 592 с.

5 Галактионов В.Г. Иммунология. – М.: РИЦ МДК, 2000. – 487 с.

6 Брондз Б.Д., Рохлин О.В. Молекулярные и клеточные основы иммунологического распознавания. – М.: Наука, 1978. – 336 с.

7 Дельвиг А.А., Робинсон Д.Г., Семенов Б.Ф. Клеточные и молекулярные основы презентации антигенов. – М.: Медицина, 2004. – 184 с.

8 Фрейдлин И.С., Тотолян А.А. Клетки иммунной системы. – СПб.: Наука, 2001. – 390 с.

9 Дранник Г.Н. Клиническая иммунология и аллергология. – Одесса: АстроПринт, 1999. – 604 с.

10 Змушко Е.И., Белозеров Е.С., Митин Ю.А. Клиническая иммунология: руководство для врачей. – СПб.: Питер, 2001. – 576 с.

11 Белозеров Е.С., Буланьков Ю.И., Митин Ю.А. Болезни иммунной системы. – Элиста: АПП «Джангар», 2005. – 272 с.

12 Земсков А.М., Земсков В.М., Караулов А.В. Клиническая иммунология. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2005. – 320 с.

13 Никулин Б.А. Оценка и коррекция иммунного статуса. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. – 376 с.

14 Коненков В.И. Медицинская и экологическая иммуногенетика. – СО РАМН, Новосибирск, 1999. – 250 с.

15 Иммунология /под ред. Пол У. – М.: Мир, 1987-1989. – Т.1. – 375 с.; – Т.2. –345 с.; –Т.3. – 360 с.

16 Петров Р.В. Иммунология и иммуногенетика. – М.: Медицина, 1976. – 338 с.

17 Вершигора А.Е. Общая иммунология. – Киев: Высшая школа, 1990. – 736 с.

18 Клиническая иммунология / Под ред. А.В. Караулова. – М.: МИА, 1999. – 604 с.

19 Иммунодефицитные состояния / Под ред. В.С. Смирнова, И.С. Фрейдлин. – СПБ.: Фолиант, 2000. – 568 с.

20 Новиков Д.К. Патология системы иммунитета. – М.: Нациоанльная академия микологии, 2003. – 368 с.

21 Новиков Д.К. Медицинская иммунология. – Минск: Высшая школа, 2005. – 301 с.

22 Клиническая аллергология: Руководство для практических врачей / Под ред. Р.М. Хаитова. – М.: МЕДпресс-информ, 2002. – 624 с.

23 Сизякина Л.П., Андреева И.И. Справочник по клинической иммунологии. – Ростов-на-Дону: Феникс, 2005. – 448 с.

24 Лебедев К.А., Понякина И.Д. Иммунная недостаточность (выявление и лечение). – М.: Мед. книга, 2003. – 443 с.

25 Воробьёв Е.И., Петров Р.В., Покровский В.М. Программа иммунологического обследования в системе массовых медицинских осмотров населения // Иммунология. – 1985. – № 5. – С. 5-7.

26 Новиков Д.К., Новикова В.И. Оценка иммунного статуса. – Москва, Витебск, 1996. – 282 с.

27 Петров Р.В. Иммунология. – М.: Медицина, 1987. – 414с.

28 Петров Р.В., Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммунодиагностика имму-нодефицитов // Иммунология. – 1997. – № 4. – С. 4-7.

29 Петров Р.В., Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Оценка иммунного статуса человека в норме и при патологии // Иммунология. – 1987. – № 6. – С. 6-9.

30 Петров, Р.В. Оценка иммунного статуса при массовых обследованиях. Методические рекомендации для научных работников и врачей практического здравоохранения (разработаны сотрудниками института Минздрава России) / Р.В. Петров [и др.] // Иммунология. – 1992. – № 6. – С. 51-62.

31 Хаитов P.M., Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Экологическая иммунология. – М.: Изд-во ВНИИРО, 1995. – 219 с.

32 Пичугина Л.В. Изменение фенотипа лимфоцитов при некоторых патологиях. – М.: Медицина, 2006. – 36 с.

ISBN ххх-хххх-хх-х-х

Учебное издание

Богачева Наталья Викторовна

СБОРНИК ЛЕКЦИЙ ПО ДИСЦИПЛИНЕ

СПЕЦГЛАВЫ ИММУНОЛОГИИ

УЧЕБНИК

Подписано в печать 25.01.13. Печать цифровая. Бумага для офисной техники. Усл. печ. л. 6,44. Тираж 50 экз. Заказ 100.

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Вятский государственный университет»

610000, Киров, ул. Московская, 36, тел.: (8332) 64-23-56, http://vyatsu.ru