Возбудители гнойно-септических инфекций. Принципы лабораторной диагностики.

Характеристика возбудителей:

Стафилококки — билет 112

Стрептококки — билет 113

Клостридии — билет 71 (возбудители анаэробной инфекции)

Лабораторная диагностика

Схема исследования отделяемого раны.

1 этап.

а) микроскопия мазка по Граму.

б) посев на питательные среды: кровяной агар (для выделения стрептококков, стафилококков), сахарный бульон (для выделения увеличения количества анаэробных и факультативных аэробных микроорганизмов), среда для контроля стерильности (тиоглеколевая среда — для выделения исключительных облигатных анаэробов).

Инкубация посевов в термостате 5 суток с ежедневным просмотром. При отсутствии роста — отрицательный ответ.

2 этап — выделение чистой культуры и ее идентификация.

3 этап — определение антибиотикорезистентности и, при необходимости, внутривидовое типирование.

Ход исследования гноя на факультативно-анаэробные микроорганизмы.

1 день.

а) Микроскопия мазка по Граму с помощью иммерсионного микроскопа (препарат фиксирован) — грам «-»

б) Посев на кровяной агар (для выделения чистой культуры) и сахарный бульон (для увеличения количества микроорганизмов)

2 день

а) Учет роста на кровяном агаре (плоские серовато-зеленые колонии, с неровными краями, 3-5 мм, окруженные гемолизом)

б) Микроскопия мазка по Грамму (грам «-» палочки)

в) Высев с сахарного бульона на кровяной агар (для выделения чистой культуры, количество которой было предварительно увеличено)

г) Откол колоний (накопление чистой культуры для дальнейшего исследования)

3 день

а) Выбор и постановка тестов (окислени/ферментация глюкозы, оксидаза, подвижность, рост при 42С)

б) Определение чувствительности к антибиотиками

в) Внутривидовое типирование

4 день

а) Учет тестов (окисление/ферментация = +/-, оксидаза(+), подвижность (+), рост при 42С (+))

б) Учет чувствительности к антибиотикам

76. Возбудители гриппа. Характеристика. Лабораторная диагностика. Специфическая профилактика.

Таксономия. Ортомиксовирусы (семейство Orthomyxoviridae) — РНК-содержащие сложноорганизованные вирусы. Семейство включает 5 родов: род Thogotovirus (передаваемые клещам арбовирусы), род Isavirus (вирус инфекционной анемии лосося) и три рода вирусов гриппа — Influenzavirus A, Influenzavirus В и Influenzavirus С.

Наибольше значение в патологии человека имеют вирусы гриппа, среди которых наибольшим антигенным разнообразием и эпидемической опасностью обладают вирусы гриппа А.

Грипп — острое инфекционное вирусное заболевание человека, характеризующееся поражением респираторного тракта, лихорадкой, общей интоксикацией, нарушением деятельности сердечно-сосудистой и нервной системы. Впервые симптомы болезни описал Гиппократ и Тит Ливий в 412 г. д н.э.

Строение и репродукция вирусов. Вирион имеет сферическую форму, могут встречаться нитевидные формы значительной длины. Диаметр вирусной частицы 80—120 нм. Вирион представляет собой нуклеокапсид (имеющий спиральный тип симметрии), покрытый липопротеиновой оболочкой.

Нуклеокапсид вирусов гриппа содержит однонитевую сегментированную минус-нитевую РНК (вирусы А и В имеют 8 сегментов, вирус С — 7) в комплексе с белком нуклеопротеином (NP), причем каждый сегмент еще соединен с тремя белками полимеразного комплекса (РВ1, РВ2, РА). На основе каждого из сегментов создается комплементарная мРНК для синтеза вирусных белков.

Первый сегмент кодирует полимеразный белок РВ1 и благодаря дополнительно рамке считывания белок PB1-F2, который имеет сродство к митохондриям и участвует в запуске апоптоза инфицированной клетки. Второй и третий сегменты кодируют белки РВ2 и Р соответственно. Данные белки полимеразного комплека необходимы для осуществления транскрипции и репликации вирусного генома. Четвертый сегмент вирусной РНК кодирует гемагглютинин, который синтезируется сначала в виде единой полипептидной цепи, а затем подвергается химическим модификациям, расщепляется на две субъединицы и в результате приобретает способность осуществлять слияние вирусной оболочки с клеточной мембраной. Пятый сегмент РНК вируса гриппа кодирует NP белок, некоторые участки которого способны связываться с РНК. Шестой сегмент у вирусов гриппа А и В кодирует нейраминидазу ( у вирусов В еще и гликопротеин NB, участвующий в транспорт ионов). Седьмой сегмент у вируса гриппа А кодирует белки Ml М2. Белок Ml образует внутренний слой оболочки вириона, а белок М2 своей центральной трансмембранной частью формирует канал для транспорта ионов внутрь вирусной частицы. Формирование таких каналов является необходимым условием для отделения нуклеокапсида от белка Ml при проникновении вирусного генома в клетку. У вирусов грипп В и С седьмой сегмент кодирует белки ВМ2 и СМ2 соответственно, а также белок Ml. Белки ВМ2 СМ2 отличаются по своей структуре от белка М2 у вируса гриппа А. Восьмой сегмент кодирует белки NS1 и NS2 (ил NEP), которые защищают вирус от воздействия интерферона (NS1) и участвуют в транспорте синтезированных в ходе репродукции нуклеокапсидов и ядра клетки в цитоплазму (NS2). Сегментированная РНК вирусов предрасположена к генетическим рекомбинациям.

Нуклеокапсид у вирусов гриппа окружен слоем белков Ml, которые составляют внутренний слой липопротеиновой оболочки. Липопротеиновая оболочка (суперкапсид) имеет клеточное происхождение. Суперкапсид включает в себя вирусные трансмембранные белки (такие, как М2, NB, BM2, СМ2) и несет на своей поверхности шипики, образованные двумя сложными белками гликопротеинами — гемагглютинином (НА) и нейраминидазой (NA). В каждом вирионе количество гемагглютинина во много раз больше, чем нейраминидазы. У вирусов типа С нейраминидазы нет. Шипики — это выросты длиной около 10 нм, шип гемагглюгинина — тример, т.е. состоит из 3 молекул белка, соединенных вместе, шип нейраминидазы — тетрамер, т.е. состоит из 4 молекул белка. На поверхности обоих гликопротеинов есть специальные области для связывания с рецепторами на чувствительных клетках. Для вирусов гриппа специфическими рецепторами являются соединения, содержащие сиаловую кислоту. Так как на мембранах клеток состав сиалоолигосахаридов разный, существует видовая и тканевая специфичность клеточных рецепторов, кроме того, у молекул гемагглютинина разных вирусов может быть разное строение «рецепторного кармана», что ограничивает круг хозяеы разных вариантов вирусов гриппа А.

Взаимодействие вирусов гриппа с клеткой начинается с того, что гемагглютинины связываются с рецепторами, а затем нейраминидаза отщепляет от них сиаловую кислоту и затем вирус проникает в клетку путем эндоцитоза. Далее происходят слияния оболочки вируса с мембраной эндосомы, частичная депротеинизация вируса и нуклеокапсид выходит в цитоплазму, а затем транспортируется в ядро клетки. В ядре клетки происходит транскрипция генов, в которой участвуют белки полимеразного комплекса. Синтез и процессинг клеточных мРНК представляют собой сложный процесс, в результате которого минус-нить каждого сегмента вирусной РНК трансформируется в комплементарные плюс-нити. мРНК транспортируются в цитоплазму, где и кодируют синтез соответствующего белка на рибосомах. При репликации генома вируса, которая идет в ядре клеток, транскрибируется все нити сегмента РНК. Сначала образуется плюс-нить, затем на матрице образуется минус-нить РНК для дочерних вирусов. Сборка нуклеокапсида происходит в ядре, куда к этому времени транспортируются синтезированные капсидные белки (NP и белки полимеразного комплекса).

Гемагглютинин, нейраминидаза, а также М-белки в процессе репродукции вирусов встраиваются в мембрану клетки-хозяина, а так как формирование вирусных частиц идет на клеточных мембранах, в которых к этому времени уже встроен гемагглютинин и нейраминидаза, то, выходя из клетки путем почкования, вирус покрываются оболочкой, уж содержащей НА-, NA и М-белки. При выходе вирусов из клетки проявляется еще одна важна функция нейраминидаз — она препятствует аггрегации новых вирионов. Кроме того, она снижает вязкость секретов, и вирусы легче проникают в нижний отдел респираторного тракта.

Антигенная структура. Внутренние и поверхностные антигены. Внутренние антигены состоят из РНК и белков капсида, представлены нуклеопротеином (NP-белком) и М-белками. NP-и М-белки — это типоспецифические антигены. NP-белок способен связывать комплемент, поэтому тип вируса гриппа обычно определяют в РСК. Поверхностные антигены — это гемагглютинин и нейраминидаза. Их структуру, которая определяет подтип вируса гриппа, исследуют в РТГА, благодаря торможению специфическими антителами гемагглютинации вирусов. Внутренний антиген – стимулирует Т- киллеры и макрофаги, не вызывает антителообразования. У вируса имеются 3 разновидности Н- и 2 разновидности N – антигенов.

Иммунитет: Во время заболевания в противовирусном ответе участвуют факторы неспецифической защиты: выделительная функция организма, сывороточные ингибиторы, альфа-интерферон, специфические IgA в секретах респираторного тракта, которые обеспечивают местный иммунитет. Клеточный иммунитет - NK-клетки и специфические цитотоксические Т-лимфоциты, действующие на клетки, инфицированные вирусом. Постинфекционный иммунитет достаточно длителен и прочен, но высокоспецифичен (типо-, подтипо-, вариантоспецифичен).

Микробиологическая диагностика. Диагноз «грипп» базируется на (1) выделении и идентификации вируса, (2) определении вирусных АГ в клетках больного, (3) поиске вирусоспецифических антител в сыворотке больного. При отборе материала для исследования важно получить пораженные вирусом клетки, так как именно в них происходит репликация вирусов. Материал для исследования — носоглоточное отделяемое. Для определения антител исследуют парные сыворотки крови больного.

Экспресс-диагностика. Обнаруживают вирусные антигены в исследуемом материале с помощью РИФ (прямой и непрямой варианты) и ИФА. Можно обнаружить в материале геном вирусов при помощи ПЦР.

Вирусологический метод. Оптимальная лабораторная модель для культивирования штаммов—куриный эмбрион. Индикацию вирусов проводят в зависимости от лабораторной модели (по гибели, по клиническим и патоморфологическим изменениям, ЦПД, образованию «бляшек», «цветной пробе», РГА и гемадсорбции). Идентифицируют вирусы по антигенной структуре. Применяют РСК, РТГА, ИФА, РБН (реакцию биологической нейтрализации) вирусов и др. Обычно тип вирусов гриппа определяют в РСК, подтип — в РТГА.

Серологический метод. Диагноз ставят при четырехкратном увеличении титра антител в парных сыворотках от больного, полученных с интервалом в 10 дней. Применяют РТГА, РСК, ИФА, РБН вирусов.

Лечение: симптоматическое/патогенетическое. А-интерферон – угнетает размножение вирусов.

1. Препараты - индукторы эндогенного интерферона. Этиотропное лечение - ремантидин – препятствует репродукции вирусов, блокируя М-белки. Арбидол – действует на вирусы А и В.

2. Препараты - ингибиторы нейраминидазы. Блокируют выход вирусных частиц из инфицированных клеток. При тяжелых формах – противогриппозный донорский иммуноглобулин и нормальный человеческий иммуноглобулин для в\в введения.

Профилактика: Неспецифическая профилактика – противоэпидемические мероприятия, препараты а-интерферона и оксолина.

Специфическая – вакцины. Для профилактики гриппа используют ремантадин, который подавляет репродукцию вируса гриппа типа А. Для пассивной профилактики применяют противогриппозный иммуноглобулин человека, полученный из сыворотки крови доноров, иммунизированных гриппозной вакциной. Определенный эффект оказывает человеческий лейкоцитарный интерферон.Для вакцинопрофилактики используют живые и инактивированные вакцины. При введении живых вакцин формируется как общий, так и местный иммунитет. Кроме того, отмечается индукция интерферона.В настоящее время получены инактивированные вакцины различных типов: вирионные, субъединичные, расщепленные и смешанные. Вирионные вакцины получают путем высококачественной очистки вирусов, выращенных в куриных эмбрионах. Субъединичные вакцины представляют собой очищенные поверхностные антигены вируса гриппа - гемагглютинины и нейраминидазу. Такие вакцинные препараты характеризуются пониженной реактогенностью и высокой иммуногенностью. Расщепленные или дезинтегрированные вакцины получают из очищенной суспензии вирионов путем обработки детергентами. Однако пока еще отсутствует единое мнение о преимуществе какой-либо одной из этих вакцин. Инактивированные вакцины индуцируют иммунный ответ в системе общего и местного гуморального иммунитета, но в меньшей степени по сравнению с живыми вакцинами индуцируют синтез интерферона. Многолетний опыт применения живых и инактивированных вакцин свидетельствует о том, что антигенное несоответствие вакцинных штаммов эпидемическим служит основной, но не единственной причиной низкой эффективности вакцинопрофилактики гриппа.