Методы изучения ферментативной активности.

В бактериологической практике для идентификации бактерий определяют сахаролитическую и протеолитическую активность ферментов.

Для определения сахаролитических ферментов используют среды с сахарами:

Ø среды Гисса (пестрый ряд):

1.жидкие – пептонная вода, индикатор Андреде (кислый фуксин), углеводы, спирты;

· 2.полужидкие – пептонная вода, 0,5% агар-агар, индикатор бромкрезол, углеводы,спирты;

· 3.короткие – содержащие моносахара и дисахара (глюкоза, мальтоза, лактоза, сахароза,маннит);

^· 4.длинные – короткий ряд + моносахара (арабиноза, ксилоза, рамноза, галактоза и др.), полисахариды (инулин, крахмал и др.), спирты (глицерин, дульцит, инозит и др.).

Ø среда Ресселя –двухсахарный агар(лактоза,глюкоза)и индикатор бромтимоловыйсиний, Олькеницкого – трехсахарный агар (лактоза, сахароза, глюкоза), индикатор нейтральный красный и соль Мора для выявления H₂S.

Под действием сахаролитических ферментов бактерий углеводы и многоатомные спирты расщепляются до кислоты/кислоты и газа. Для обнаружения газа в жидкие среды помещают поплавки, которые при образовании газа всплывают, а в полужидких – заметно появление пузырьков. Для обнаружения кислоты добавляют индикатор, который под ее действием изменяет цвет.

Ø среды Эндо, Левина, Плоскирева –МПА с лактозой и индикаторами–фуксином,метиленовым синим и нейтральным красным соответственно.

У бактерий, ферментирующих лактозу (лактоза+), колонии окрашиваются в цвет индикатора и приобретают металлический блеск, у лактоза– бактерий колонии остаются бесцветными.

Для определения протеолитических ферментов используют:

Ø определение конечных продуктов распада белков (индол, H₂S, аммиак);

Сероводород, индол и аммиак определяют, помещая под пробку пробирки с растущей на МПБ культурой индикаторные бумажки:

· индол (выделяется при разложении триптофана), окрашивает в розовый            цвет индикаторную бумажку, пропитанную щавелевой кислотой;

· H2S (продукт распада серосодержащих аминокислот – цистеина, метионина), реагируяацетатом свинца на индикаторной бумажке, превращается в сульфат свинца и окрашивает бумажку в черный цвет;

· о наличии аммиака свидетельствует посинение лакмусовой бумажки.

Ø способность разжижать желатин (в виде воронки, перевернутой елочки);

Ø способность свертывать или пептонизировать плазму крови и молоко.

62.Чистые культуры микроорганизмов. Принципы и методы выделения.

Методы выделения чистой культуры бактерий

Чистая культура - популяция бактерий одного вида, выращенная на питательной среде.

Для выделения чистой культуры необходимо получить изолированные колонии на плотной среде

Методы выделения чистой культуры бактерий, основанные на механическом разобщении клеток

1. Глубинный посев по Коху.

Исследуемый материал вносится мерно в расплавленный и остуженный питательный агар, тщательно перемешивается с питательной средой и выливается в пустую стерильную чашку Петри. После затвердевания агара чашка помещается в термостат. Изолированные колонии вырастают на поверхности среды и в ее толще.

Достоинства метода

• метод может использоваться для количественного определения микроорганизмов в исследуемом материале

Недостатки метода

• микроорганизмы растут как на поверхности среды, так и в ее толще, что затрудняет "откол" колонии для последующего исследования

2. Посев истощающим штрихом.

Исследуемый материал наносится на край чашки Петри с питательной средой и распределяется бактериологической петлей на 3-4 сектора в виде штрихов. Количество микроорганизмов закономерно уменьшается от первого сектора к последнему и после инкубации на одном из секторов получаем изолированные колонии.

Достоинства метода

• техническая простота метода

• эффективное разделение бактерий

• есть много модификаций, которые можно выбрать в зависимости от типа исследуемого материала

•
есть модификации, позволяющие проводить полуколичественные исследования (например, метод СоИ при исследовании мочи)

Недостатки метода

■ при большом количестве сопутствующей микрофлоры колонии искомых микроорганизмов могут располагаться в зоне сплошного роста сопутствующих микроорганизмов.

3. Посев шпателем по Дригальскому.

Исследуемый материал наносится на питательную среду в чашке Петри и равномерно распределяется по поверхности при помощи бактериологического шпателя. При определенном навыке метод позволяет получить хорошо изолированные колонии в большинстве случаев.

При мерном нанесении материала на чашку метод иногда считают количественным, что не верно, поскольку' на шпателе остается неконтролируемое количество бактерий.

Методы выделения чистой культуры бактерий, основанные на различиях в биологических свойствах

1. Использование селективных (селективно-дифференциальных) питательных сред

Внесение в питательную среду селективной добавки позволяет подавить рост сопутствующей микрофлоры, что облегчает получение изолированных колоний целевого микроорганизма. Технически процедура посева не отличается от методов, указанных выше.

Достоинства метода

■ возможность выделять микроорганизмы из смеси, в которой сопутствующая микрофлора доминирует, превосходя целевой на несколько порядков.

Недостатки метода

■ нет абсолютных селективных сред. Обычно достичь полного подавления сопутствующей микрофлоры не удается.

■ селективная среда не является оптимальной средой для целевого микроорганизма. Это приводит к удлинению времени инкубации, изменению некоторых свойств, частичному подавлению.

2. Обработка исследуемого материала кислотой (или щелочью) перед посевом.

Метод применяется при выделении кислото и щелочеустойчивых бактерий.

Уничтожение сопутствующих микроорганизмов позволяет произвести высев на неселективную среду.

Достоинства метода

■ Высокая эффективность при уничтожении контаминантов

■ Возможность не использовать селективные среды

3. Прогревание исследуемого материала при 80 °С

Для выделения споробразующих бактерий можно прогреть исследуемый материал 20 мин. при 30 °С. Все вегетативные клетки бактерий (в том числе спорообразующих) погибнут, а споры сохранят жизнеспособность. Дальнейший высев можно осуществлять на неселективные среды.

Достоинства метода.

■ Высокая эффективность удаления сопутствующей микрофлоры

■ Возможность использования неселективных питательных сред

А. Фильтрация через бактериальные фильтры

Метод может быть использован при выделении микроорганизмов, размер которых меньше, чем сопутствующей микрофлоры. В этом случае фильтр задерживает контаминанты. а целевой микроорганизм проходит через поры фильтра к питательной среде.

Пример использования. Выделение бактерий рода Сатру1оЬас1ег

Достоинства метода.

■ Отсутствие подавления целевого микроорганизма селективной средой.

■ Снижение стоимости исследования (неселективная среда дешевле селективной)

Недостатки метода.

■ Ограниченное применение

■ Трудоемкость выше, чем при посеве на селективную среду

5. Использование активной подвижности на агаровых средах

Метод Шукевича предназначен для выделения бактерий рода Рго1е115. Посев проводят в конденсатную воду свежескошенного питательного агара. За счет "роения" протей образует макроколонию на всей свободной поверхности агаровой среды.

Достоинства метода.

■ Простота и высокая эфективность

■ Низкая стоимость

Недостатки метода

Ограниченное применение (только для бактерий рода Proteus)

63.Энергетический метаболизм у бактерий. Типы энергетического метаболизма. Типы дыхания.

Метаболизм (обмен веществ)–это совокупность всех протекающих в клетке химическихпревращений, обеспечивающих воспроизводство ее биомассы и жизнеспособность.

Метаболизм складывается из 2-х взаимосвязанных, но противоположных процессов:

катаболизма и анаболизма.

Катаболизм (энергетический метаболизм / диссимиляция)–это процессы расщеплениясложных молекулярных соединений до более простых, идущие с выделением энергии и запасанием ее в молекулах АТФ и других макроэргических соединений.

Анаболизм (конструктивный / пластический метаболизм / ассимиляция / биосинтез)–этореакции, в результате которых синтезируются сложные соединения и структурные компоненты клетки за счет поступающих извне простых веществ, идущие с потреблением энергии, полученной в процессе энергетического метаболизма.

Необходимо отметить, что на определенных этапах анаболизма и катаболизма образуются одинаковые промежуточные продукты (амфиболиты), которые используются в обоих процессах.