Окраска микроорганизмов - комплекс методов изучения структуры и морфологии микроорганизмов при микроскопии препаратов, приготовленных из чистых культур или исследуемого материала.

• Тинкториальные свойства - это свойства бактерий, грибов и простейших, характеризующие их способность вступать в реакцию с красителями и окрашиваться определенным образом.

Цели:

• Определение микробного пейзажа

• Определение чистоты выделенной культуры

• Изучение морфологических особенностей микроорганизмов

Препараты в микробиологии:

Прижизненные (нативные):

• Метод «висячей» капли

• Метод «раздавленной» капли

• Прижизненная окраска

Фиксированные:

Простые методы окраски

Сложные методы окраски

Люминисцентные красители (акридиновый желтый, ауромин, корифосфин)

Электронная микроскопия

Методы окраски нативных препаратов:

• Для витальной окраски микроорганизмов (окраски живых микроорганизмов) красители применяют в больших разведениях (1:10 000— 1:100 000), чтобы избежать артефактов, появляющихся в результате токсического действия красителя на живые микроорганизмы. Чаще всего для витальной окраски используют метиленовый синий, нейтральный красный и др.

Методы окраски фиксированных препаратов:

Простые

• окраску метиленовым синим

• фуксином Пфейфера

• генциан виолетом

Сложные

• окраска по методу Грама

• окраска по Цилю — Нельсену

• окраска по Романовскому — Гимзе

Красители:

• Красящие растворы готовят из анилиновых красителей. Красители бывают основные (щелочные) и кислые. Кислые красители легко окрашивают элементы клеток, имеющие щелочную реакцию, конкретно протоплазму, поэтому их называют протоплазматическими. Кислые красители бактерий не окрашивают. Употребляют их лишь для прокрашивания фона препарата.

• Основные красители окрашивают ядра клеток, поэтому их называют ядерными. Бактерии окрашиваются почти исключительно основными красителями.

• Важнейшие основные красители: красные — нейтральрот, пиронин, сафранин, фуксин основной; фиолетовые — генцианвиолет, кристаллвиолет, метилвиолет, тионин; синие — метиленовая синь, виктория; зеленые — малахитовая зелень, метиловая зелень; коричневые — везувин, хризоидин; черный — индулин.

• Главные кислые красители: красные — кислый фуксин, эозин; желтые — ауранция, пикриновая кислота; черный — нигрозин. Красители имеют вид порошков или кристаллов, для окраски микробов из них готовят водные и спиртовые растворы.

Методы окраски мазков

Простой метод. Фиксированный мазок окрашивают каким-либо одним красителем, например фуксином водным (1—2 мин) или метиленовым синим (3—5 мин), промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Сложные методы. Включают последовательное нане­сение на препарат красителей, различающихся по химическому составу и цвету, протрав и дифференцирующих веществ. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других.

Окраска по методу Грама.1. На фиксированный мазок наносят карболово-спиртовой раствор генцианового фиолето­вого через полоску фильтровальной бумаги. Через 1—2 мин ее снимают, а краситель сливают.Наносят раствор Люголя на 1—2 мин.Обесцвечивают препарат этиловым спиртом в течение 30—60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.Промывают препарат водой.Докрашивают мазок водным раствором фуксина в тече­ние 1—2 мин, промывают водой, высушивают и микроскопи- руют.

Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиоле­товый цвет, грамотрицательные — в красный (рис. 16).

Отношение бактерий к окраске по Граму определяется их способностью удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс генцианового фиоле­тового с йодом. Это зависит от различий в химическом составе и в прони­цаемости клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также от соотношения РНК и ДНК в их цитоплазме. В клеточной стенке грамположительных бактерий наиболее выражен муреиновый (мукопептидный слой), содержащий гликопептиды и тейхоевую кислоту. Пептидогликаны грамположительных бактерий структурно отличаются от грамотрицательных бактерий. Тейхоевые кислоты стабилизируют ионы магния на поверхности клеток. У грамположительных бактерий на поверхности клетки имеется комп­лекс протеин — рибонуклеат магния; соотношение РНК и ДНК в их цитоплазме составляет 8 :1; у грамотрицательных бактерий это соотношение равно 1 :1. Изоэлектрическая точка цитоплазмы у грамположительных бактерий находится при pH 2,0—3,0, у грамотрицательных — около 5,0. После обработки раствором йода, являющегося окислителем, происходит сдвиг изоэлектрической точки в кислую сторону, выраженный у грамположительных бактерий в большей степени, чем у грамотрицательных.

Кроме того, проницаемость клеточной стенки у грамположительных бак­терий меньше, чем у грамотрицательных. Таким образом, у грамположительных бактерий создаются оптимальные условия для прочной фиксации красителя и резистентности к обесцвечиванию спиртом.

Окраска по Граму имеет важное дифференциально-диаг­ностическое значение и широко используется в микробиологии. К грамположительным бактериям относятся стафилококки, стрептококки, коринебактерии дифтерии, микобактерии тубер­кулеза и др., к грамотрицательным—гонококки, менингококки, кишечная палочка и др. Некоторые виды бактерий могут ок­рашиваться по Граму вариабельно в зависимости от возраста, особенностей культивирования и других факторов, изменяющих структуру клеточной стенки.

Основная ошибка, допускаемая при окраске по Г раму,

состоит в переобесцвечивании или недообесцвечивании мазка спиртом. В первом случае грамположительные бактерии мо­гут утрачивать первоначальную окраску генциановым фиоле­товым и приобретать красный цвет (характерный для грамот- рицательных бактерий) в результате последующей докраски мазка фуксином. Во втором случае грамотрицательные бакте­рии могут сохранять сине-фиолетовый цвет генцианового фиолетового. Для правильной окраски следует строго соблю­дать технику обесцвечивания (см. п. 3 описания окраски по Г раму).

Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля—Нельсена. 1. На фиксированный мазок наносят карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогревают до появления паров в течение 3—5 мин.Снимают бумагу, промывают мазок водой.На мазок наносят 5% раствор серной кислоты или 3% раствор солянокислого спирта на 1—2 мин для обесцвечи­вания.Промывают водой.Докрашивают мазок водным раствором метиленового синего в течение 3—5 мин.Промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Кислотоустойчивость обусловлена наличием в клеточной стенке и цитоплазме бактерий повышенного количества ли­пидов, воска и оксикислот, в частности миколовой кислоты. Раствор карболовой кислоты разрыхляет клеточную стенку и тем самым повышает ее тинкториальные свойства, а высо­кая концентрация красителя и нагревание в процессе окраски усиливают реакцию взаимодействия красителя с бактериальными клетками, которые окрашиваются при этом в красный цвет. При обработке препарата серной кислотой некислотоустойчи­вые бактерии обесцвечиваются и окрашиваются метиленовым синим в голубой цвет, а кислотоустойчивые бактерии остают­ся окрашенными фуксином в красный цвет

Окраска спор по методу Ожешки.1. На нефиксированный мазок наносят 0,5% раствор хлористоводородной кислоты и подогревают на пламени горелки в течение 2—3 мин.Кислоту сливают, препарат промывают водой, просуши­вают и фиксируют над пламенем горелки.Окрашивают препарат по Цилю —Нельсену. Споры бакте­рий при этом приобретают красный цвет, а вегетативные фор­мы—синий .

Окраска зерен волютина по методу Нейссера.1. На фикси­рованный мазок наносят ацетат синьки Нейссера на 2—3 мин.Наносят раствор Люголя на 10—30 с.Промывают препарат водой.Мазок докрашивают водным раствором везувина или хризоидина в течение 'А—1 мин.Промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Зерна волютина представляют собой соединения, имеющие в отличие от цитоплазмы щелочную реакцию и поэтому избирательно воспринимают ацетат синьки, окрашиваясь в темно-синий цвет. Цитоплазма клетки, обладающая кислой ре­акцией, воспринимает щелочной краситель везувин и окраши­вается в желтый цвет (рис. 19).

Обнаружение капсул по методу Бурри—Гинса.1. Готовят препарат по Бурри: смешивают каплю взвеси микробов с кап­лей туши и при помощи стекла со шлифовальным краем готовят мазок так же, как мазки из крови; затем его высу­шивают и фиксируют.На мазок наносят водный раствор фуксина на 1—2 мин.

Промывают водой, высушивают на воздухе и микроско­пируют. При этом бактерии окрашиваются в красный цвет, а неокрашенные капсулы контрастно выделяются на черно­розовом фоне.

КОН-тест

Принцип метода

В каплю 3% КОН вносят полную петлю исследуемой культуры Расти-рают культуру петлей в течение 30 сек. периодически отрывая петлю от стекла.

Щелочь разрушает клеточную стенку грамотрицательных бактерий, и клеточное содержимое выходит наружу, вследствие чего вязкость капли резко возрастает Содержимое капли тя-нется за петлей до 3-10 мм Грамположительные бактерии не лизируются и вязкость капли на стекле не изменяется

Метод применим только при работе с чистой культурой

58.Типы и механизмы питания бактерий. Классификация бактерий по используемым источникам углерода и энергии. Прототрофы и ауксотрофы..

В отличие от животных и растительных организмов, микроорганизмы характеризуются разнообразием и типов питания, которые выделяют по трем основным критериям –– источник углерода, источник энергии и донор электронов (водорода).

В зависимости от природы источника углерода все микроорганизмы разделены на 2 большие группы –– автотрофы, использующие углекислоту, и гетеротрофы, требующие для роста и размножения готовых органических веществ. С учетом разнообразия источников энергии и доноров электронов эти группы подразделены на подгруппы, в результате чего у микроорганизмов выделены 8 типов питания. Каждый тип питания характерен для определенных микроорганизмов и отражает их физиолого-биохимические свойства.

Большинство микроорганизмов, в том числе и патогенных, имеют тип питания, при котором источником углерода, энергии и донорами электронов являются органические вещества.

Типы питания бактерий.

Особенности питания бактерий:

· экзогенный тип питания (выделяя гидролитические ферменты в окружающую среду, расщепляют макромолекулы доболее простых соединений, которые поступают внутрь клетки);

· голофитный тип питания (поступление веществ из вне только в растворенном состоянии);

· поступление веществ происходит через всю поверхность бактериальной клетки;

· потребление веществ в сутки в 20-30 раз больше своей массы;

· интенсивность метаболизма у прокариотов выше, чем у эукариотов на 50-60% (в 100 раз);

· очень высокая адаптивность к различным условиям существования.

Для микроорганизмов характерно многообразие способов питания. Классификациямикроорганизмов по типам питания:

По источнику углерода:

Øавтотрофы=«сами себя питающие» (от греч. autos –сам, trophe –пища)

способны получать весь углерод в результате фиксации CO2 (единственный источник углерода – СО2

воздуха);

Øгетеротрофы=«питающиеся за счет других» (от греч.   heteros  –        другой)

получают углерод из различных органических соединений, эта группа наиболее многочисленна по своему составу, включает паразитов и сапрофитов:

Ø паразиты (паратрофы, от греч. parasitos –нахлебник) используют для своего питанияорганические соединения живых организмов, обитают на поверхности или внутри макроорганизма, нанося ему вред, подразделяются на:

           · облигатные паразиты –полностью лишены способности жить вне клетокмакроорганизма;

·факультативные паразиты –могут существовать и вне макроорганизма;

Ø сапрофиты (метатрофы, от греч. sapros –гнилой, phyton –растение) нуждаются вготовых органических соединениях, поэтому питаются мертвой тканью животных и растений.

По источнику энергии:

фототрофы (фотосинтезирующие)используют энергию солнечного света;

хемотрофы (хемосинтезирующие)получают энергию за счет окислительно-восстановительных реакций.

По донору электронов:

литотрофы (от греч. lithos –камень)в качестве источника электронов используютнеорганические соединения (H₂, NH₃, H₂S, S и т.д.);

органотрофы используют органические соединения в качестве доноров электронов.

Можно использовать все критерии сразу для характеристики микроорганизмов или только два. Например, фотоавтолитотрофы – микроскопические водоросли; хемоорганогетеротрофы – стафилококки, кишечная палочка. Однако, такая классификация не полностью отражает способности микроорганизмов. Многие микроорганизмы обладают «гибким» метаболизмом и могут переключаться в определенных условиях с одного способа питания на другой. Поэтому выделяют термины облигатный и факультативный, так например, облигатному фотоавтотрофу обязательно нужен свет и CO₂ как источник углерода, а факультативные фотоавтотрофы могут расти и на органических кислотах.

По источнику азота:

аминоавтотрофы используют атмосферный азот и минеральные соединения азота дляпостроения органических соединений (почвенные бактерии);

аминогетеротрофы получают азот для синтеза белков из органических соединений(патогенные бактерии).

По способности синтезировать необходимые питательные вещества:

прототрофы –это микроорганизмы,способные синтезировать все необходимые иморганические соединения из глюкозы и солей аммония;

ауксотрофы не способны синтезировать некоторые органические соединения,ассимилируя их в готовом виде из окружающей среды или организма хозяина.

Механизм поступления веществ в клетку (сложный физико-химический процесс,в которомбольшую роль играют концентрация веществ, их строение, растворимость, размеры молекул, проницаемость ЦПМ, наличие ферментов, pH среды, изоэлектрическая точка вещества цитоплазмы):

пассивная диффузия –питательные вещества в клетку перемещаются по градиентуконцентрации без затрат энергии (когда концентрация вещества снаружи значительно превышает концентрацию внутри); этим путем в бактериальную клетку поступает ограниченное количество веществ – H₂O, O₂, CO₂ и NH₃;

облегченная диффузия осуществляется тоже по градиенту концентрации без затратэнергии, но с помощью особых белков-пермеаз, которые находятся в цитоплазматической мембране;

активный транспорт осуществляется пермеазами против градиента концентрации(концентрация вещества в клетке может быть значительно больше, чем в питательной среде), сопровождается затратой энергии;

транслокация (фосфорилирование) –химическая модификация вещества при переносечерез ЦПМ с помощью белков-транслоказ; так, например, поступает в клетки глюкоза;

обменная адсорбция –способность электрически заряженной поверхности микробнойклетки притягивать вещества с противоположным зарядом.

59. Токсины бактерий, их природа и свойства. Получение и применение экзо- и эндотоксинов.

Важную роль в развитии инфекционного процесса играют токсины. По биологическим свойствам бактериальные токсины делятся на экзотоксины и эндотоксины.
Экзотоксиныпродуцируют как грамположительные, так и грамотрицательные бактерии. По своей химической структуре это белки. По механизму действия экзотоксина на клетку различают несколько типов: цитотоксины, мембранотоксины, функциональные блокаторы, эксфолианты и эритрогемины. Механизм действия белковых токсинов сводится к повреждению жизненно важных процессов в клетке: повышение проницаемости мембран, блокады синтеза белка и других биохимических процессов в клетке или нарушении взаимодействия и взаимокоординации между клетками. Экзотоксины являются сильными антигенами, которые и индуцируют образование в организме антитоксинов.
По молекулярной организации экзотоксины делятся на две группы:
• экзотоксины, состоящие из двух фрагментов;
• экзотоксины, составляющие единую полипептидную цепь.
По степени связи с бактериальной клетки экзотоксины делятся условно на три класса.
• Класс А - токсины, секретируемые во внешнюю среду;
• Класс В - токсины частично секретируемые и частично связанные с микробной клеткой;
• Класс С - токсины, связанные и с микробной клеткой и попадающие в окружающую среду при разрушении клетки.
Экзотоксины обладают высокой токсичностью. Под воздействием формалина и температуры экзотоксины утрачивают свою токсичность, но сохраняют иммуногенное свойство. Такие токсины получили название анатоксины и применяются для профилактики заболевания столбняка, гангрены, ботулизма, дифтерии, а также используются в виде антигенов для иммунизации животных с целью получения анатоксических сывороток.
Эндотоксиныпо своей химической структуре являются липополисахаридами, которые содержатся в клеточной стенке грамотрицательных бактерий и выделяются в окружающую среду при лизисе бактерий. Эндотоксины не обладают специфичностью, термостабильны, менее токсичны, обладают слабой иммуногенностью. При поступлении в организм больших доз эндотоксины угнетают фагоцитоз, гранулоцитоз, моноцитоз, увеличивают проницаемость капилляров, оказывают разрушающее действие на клетки. Микробные липополисахариды разрушают лейкоциты крови, вызывают дегрануляцию тучных клеток с выделением вазодилататоров, активируют фактор Хагемана, что приводит к лейкопении, гипертермии, гипотонии, ацидозу, диссеминированной внутрисосудистой коагуляции (ДВК).
Эндотоксины стимулируют синтез интерферонов, активируют систему комплемента по классическому пути, обладают аллергическими свойствами.
При введении небольших доз эндотоксина повышается резистентность организма, усиливается фагоцитоз, стимулируются В-лимфоциты. Сыворотка животного иммунизированного эндотоксином обладает слабой антитоксической активностью и не нейтрализует эндотоксин.
Патогенность бактерий контролируется тремя типами генов: гены - собственной хромосомами, гены, привнесенные плазмидами и умеренными фагами.