Бактеріоскопічний метод дослідження, етапи. Оцінка. Вплив робіт Роберта Коха на прогрес мікробіології.

У лабораторній практиці використовують такі типи мікроскопічних препаратів: 1) висячу краплю 2) придавлену краплю 3) тонкий мазок крові, гною, мокротиння та ін; 4) товсту краплю 5) агар-мікроскопію 6) препарат-відбиток 7) фіксований мазок. У Бактеріологічній практиці частіше застосовують останній тип препарату. Приготування його складається з декількох етапів: 1) забору і доставки матеріалу для дослідження 2) приготування препарату. Для цього досл. матеріал наносять на чисте, знежирене предметне скло з допомогою бактерій. петлі і розподіляють по площі в 1 см2. Щільний (густий) матеріал або к-ру з щільного середовища вносять бактерій. петлею в краплину фізрозчину, ретельно розмішують і розподіляють по склу на такому ж просторі, як і в попередньому випадку. Величина внесеного матеріалу залежить від передбачуваної кількості бактерій в ньому. 3) приготовлений мазок висушують на відкритому повітрі або в теплому струмені повітря (від газового пальника), 4) препарат фіксується на склі для забезпечення безпеки подальшої роботи, прикріплення бактерій до скла, кращого сприйняття ними фарби, оскільки структури вбитих бактерій легше і міцніше сприймають барвники; 5) фіксовані мазки забарвлюють одним з простих або спеціальних методів фарбування , занурюючи мазок в барвник або наливаючи його на препарат так, щоб вся поверхня препарату була вкрита суцільним шаром барвника, і добре просушують на повітрі. Погано висушений препарат дає каламутне зображення при імерсійної мікроскопії через утворення емульсії; 7) мікроскопії мазка.

Бактеріологічний метод дослідження. Принципи та методи виділення чистої культури, її ідентифікація.

Оснований на посіві матеріалу, виділення чистої культури і її ідентифікації.

Виділення чистої культури аеробних мікроорганізмів:
Перший день (І етап дослідження)у стерильний посуд (пробірка, колба, флакон) забирають патологічний матеріал, вивчають за зовнішнім виглядом, консистенцією, кольором, запахом, готують мазок, фарбують і досліджують під мікроскопом. Посів проводять бактеріологічною петлею, за допомогою шпателя за методом Дригальського, ватно-марлевим тампоном. Чашки закривають, перевертають догори дном, підписують спеціальним олівцем, ставлять у термостат при оптимальній т (37 °С) на 18-48 год. Мета — одержати ізольовані колонії мікроорганізмів.
Другий день (ІІ етап дослідження)на поверхні щільного живильного сере­довища мікроорганізми утворюють суцільний, густий ріст/ізольовані колоніїЧашки ретельно розглядають, вивчають ізольовані колонії, що виросли на поверхні агару
Характеристика колоній – важлива складова частина роботи, мікроорганізмам кожного виду притаманні свої особливі колонії.. З підозрілих колоній готують мазки, забарвлюють за методом Грама для вив­чення морфологічних та тинкторіальних властивостей збудників, досліджують рухо­мість бактерій у "висячій" чи "надавленій" краплі. Рештки досліджуваних колоній знімають із поверхні середовища, засівають на скошений агар/на сектори чашки Петрі із живильним середовищем для одержання чистої культури. Пробірки/ чашки з посівами – у термостат при оптимальній температурі на 18-24 год.
Виготовляється мазок, забарвлюється, досліджується, а мікроорганізми засіваються петлею на поверхню щільного жи­вильного середовища для одержання ізольованих колоній.
Третій день (III етап дослідження)вивчають характер росту чистої куль­тури мікроорганізмів, ідентифікують. Вивчають біохімічні властивості: цукролітичні, протеолітичні, пептолітичні, гемолітичні властивості, утворення ферментів декарбоксилаз, оксидази, каталази, плазмокоагулази. Існують спеціальні живильні середовища, які засівають м/о (строкатий ряд Гісса, МПБ, згорнута сироватка, молоко та ін.).

19. Вплив фізичних, хімічних та біологічних факторів на мікроорганізми. Стерилізація, методи, контроль ефективності стерилізації. Асептика. Антисептика.                                  Фізичні: вплив температури ( психофіли -холодолюбні, мезофіли , термофіли з теплолюбні), висушування, вплив променевої енергії, вплив осмотичного тиску, вплив рН.                               Хімічні: Одні хімічні речовини можуть використовуватися як поживні, інші не змінюють фізіологічної активності,бактеріостатичні-призупиняють ріст і розмноження,бактеріоцидні-знищують мо. Біологічні: Вплив одних мо на інші-симбіоз(асоціативний і конкурентний).

Стерилізація-сукупність фізичних і хімічних способів повного звільнення об'єкта стерилізації від усіх видів життєздатних форм мо. Методи:                                                                                                                 1. Стерилізація фільтруванням-фільтрація повітря за допомогою вентиляції,яка забезпечує 40-кратний за годину обмін повітря. сюди відносять стерилізацію парою в автоклаві.                                                   2. Променева стерилізація: -УФ-призводить дотокислення сульфгідрильних груп і пошкодження ДНК бактерій енергією випромінювання. -Гамма-промені-утворюють в мікробах вільні радикали, ушкоджує нуклеїнові кислоти і ферментні системи(використ. кобальт або цезій)                                            3. Хімічна стерилізація-використання 6% розчину пероксиду водня на 6 год. при 18С або на 3 год. при 50С. Хімічна газова стерилізація-використ. герметичну камеру-газовий стерилізатор.

Антисептика-способи знищення небезпечних мо у ранах, на шкірі, слизових оболонках, та у порожнинах тіла з метою попередження розвитку та лікування інфекційних процесів.                Асептика- комплекс антимікробних заходів деконтамінації об'єктів зовнішнього середовища,націлених на запобігання попадання  в організм людини

Хіміотерапія та хіміотерапевтичні препарати. Хіміотерапевтичний індекс. Механізми антибактеріальної дії сульфаніламідів. Роль П. Ерліха та Г. Домагка у розвитку вчення про хіміотерапію.

Хіміотерапія- лікування інфекційних захворювань за допомогою препаратів які вибірково придушують в організмі розмноження патогенних мікроорганізмів або ріст пухлини. Ці засоби мають важливу властивість-вибіркову дію проти хвороботворних мікроорганізмів в умовах мікроорганізма. Антибіотики — речовини мікробного, тваринного, рослинного походження, їх синтетичні чи напівсинтетичні аналоги і похідні, які вибірково пригнічують життєдіяльність мікроорганізмів, вірусів, найпростіших, грибів, а також затримують ріст пухлин. При хіміотерапії відбувається взаємодія трьох елементів: хіміотерапевтичного препарату, макроорганізму і мікроорганізму.

Хіміотерапевтичний індекс- відношення максимальної дози препарату що переноситься хворим до мінімальної терапевтичної дози.

Механізм хіміотерапевтичної дії сульфаніламідних препаратів грунтується на спільній структурі їх з пара- амінобензой-ною кислотою (ПАБК), завдяки чому вони, конкуруючи а нею, залучаються до метаболізму бактерій.

Шляхом конкуренції з ПАБК сульфаніламіди перешкоджають використанню її мікроорганізмами для синтезу кислоти дигідрофоліевої. Кислота дигідрофолієваза участю редуктази перетворюється на метаболічно активний кофермент —кислоту тетрагідрофолісву, що бере участь у процесах синтезу піримідинових основ ДНКта РНК. Мікробна клітина має деяку кількість накопиченої ПАБК, тому дія сульфаніламідів спостерігається після певного латентного періоду, протягом яко­го відбувається 5,5 ± 0,5 генерації.

Явище антагонізму у мікробів. Роль вітчизняних мікробіологів у розвитку вчення про антагонізм бактерій. Антибіотики: характеристика, принципи одержання, одиниці виміру активності. Класифікація за механізмом дії на мікроорганізми. Спектр дії антибіотиків.

Антибіотики — речовини мікробного, тваринного, рослинного походження, їх синтетичні чи напівсинтетичні аналоги і похідні, які вибірково пригнічують життєдіяльність мікроорганізмів, вірусів, найпростіших, грибів, а також затримують ріст пухлин. Перший ефективний антибіотик (пеніцилін) (Гр+) відкритий Флемингом у 1929 р. 2-й антибіотик (стрептоміцин) (Гр-) відкрив Висман.

Основні принципи технології одержання антибіотиків.

1. Пошук і селекція штаму-продуцента. Як правило, для виробництва застосовують штами-мутанти, одержані при радіаційному мутагенезі.     

2. Підбір умов культивування та відповідних середовищ. Вирощування штаму-продуцента ведуть у ферментерах, як правило, глибинним методом, часто за безперервними технологіями, що дозволяють відбирати середовище з продуктом протягом усього виробничого циклу.                  

     3. Виділення антибіотика з культуральної рідини: фільтрування, екстракція органічними речовинами, адсорбція на іонообмінних смолах із наступним вимиванням.                                                  

4. Очистка одержаного препарату. Ведеться різними фізико-хімічними способами, препарати не повинні містити продуктів життєдіяльності клітин-продуцентів та компонентів середовища.                  

5. Перевірка на біологічну активність (використовуються передбачені технічними умовами та регламентом виробництва тестові мікроорганізми).                                                                                                        

6. Стандартизація. Активність антибіотика вимірюється в міжнародних одиницях (МО) — специфічна активність щодо тестового мікроорганізму, яка відповідає 1 мкг чистого препарату антибіотика. Для пеніциліну 1 МО (оксфордська одиниця) — найменша кількість препарату, що затримує ріст стандартного штаму стафілокока (штам 209) в 1 мл середовища. Вона дорівнює 0,6 мкг чистого препарату.

За механізмом дії: 1. Інгібітори снтезу клітинної стінки мікроорганіхмів: пеніциліни, цефалоспорини, киклосерин, ванкоміцин, бацитрацин.                                                                                                                                  

2. Інгібітори функції мембран та антибіотики, які мають детергентні властивості:поліміксини, новобіоцин, полієни (ністатин, амфотирицин Б).                                                                                                               

3. Інгібітори синтезу білка та функції рибосом:тетрацикліни, хлорамфенікол (левоміцитин), аміноглікозиди, макроліди, лінкоміцин.                                                                                                                        4 Інгібітори метаболізму нуклеїнових кислот: а) інгібітори РНК-актиноміцини, антибіотики групи ауреолової кислоти, антрацикліни, новобіомицин; б) інгібітори ДНК – мітоміцин С, брунеоміцин, новобіоцин, лінкоміцин.

За спектром дії: 1. Активні по відношенню до Гр+ МіО особливо: бензилпеніцилін, напівсинтетичні пеніциліни та цефалоспорини, макроліди, фузидін, лінкоміцин.                                                             

2. Широкого спектру дії активні до Гр+ та Гр- МіО: напівсинтетичні пеніциліни, цефалоспорини 2-го—4-го поколінь, тетрацикліни, хлорамфенікол. Аміноглікозиди та поліміксини діють переважно на грамнегативні бактерії.                                                                                                                                              3. Протитуберкульозні: стрептоміцин, канаміцин, віоміцин (флоріміцин), циклосерин та ін.                       

4. Протигрибкові: ністатин, реворин, амфотерицин Б, грізеофульвін та ін.                                                   

        5. Активні за дією до найпростіших: Фугамілін, трихоміцин, паромоміцин (мономіцин)                      

        6. Протипухлинні: актиноміцетин, група ауреолової кислоти, антрацикліни. Антагонізм мікробів виявляється в тім що при вирощуванні в живильному середовищі різних видів один з них має здатність придушувати ріст і розмноження іншого.

Лікарська стійкість мікробів, механізм утворення стійких форм. Методи визначення чутливості мікробів до антибіотиків. Мінімальна пригнічуюча концентрація (МПК). Практичне значення. Принципи боротьби з лікарською стійкістю мікроорганізмів.

Стійкість мікробів до антибіотиків – ріст бактерій у присутності мінімальної концентрації гнітючих антибіотиків. Розрізняють два типи стійкості мікроорганізмів до антибіотиків: природну та набуту. Природна стійкість є видовою ознакою. Вона властива всім представникам даного виду і не залежить від первинного контакту з відповідним антибіотиком.                                                             Набута стійкість виникає в окремих представників даного виду бактерій як результат змін її геному. Частина генетичних змін пов'язана з мутаціями в генах бактеріальної хромосоми. У результаті бактерія перестає бути мішенню для даного антибіотика внаслідок зміни біохімічних процесів, або тому, що антибіотик не може досягнути мішені.                                                                                              

Способи боротьби з лікарською стійкістю:                                                                                                                         

1. Застосування антибіотиків на основі чутливості до них збудника.                                                                       

2. Дотримання схем застосувань антибіотиків, їхнії доз (особливо для бактеріотичних).                           

3. Комбінування антибіотиків різних механізмів дій (широкого спектру дії з протигрибковим, щоб не було кандидоза).                                                                                                                                                                 4. Використ антибіотиків із резервом.                                                                                                                                         

Є 2 методи визначення чутливості:                                                                                                                          

- методи серійних розведень (антибіотики послідовно розводять у рідкому живильному середовищі, одержуючи зменшення концентрації. МПК – це мінімальна кількість антибіотиків, що придушує ріст чутливого мікроба (тест) у певному обємі середовища. МПК визначають для оцінки ЕЕ. Якщо дії антибіотика бактеріостатичні – буде ріст.                                                                                                                                  - метод заснований на дифузії антибіотиків у МПА. Цей метод має різні варіанти: а) метод лунок; б) метод дисків. Принцип методу на поверхню МПА засівають досліджувану або тест-культуру бактерій. Потім на поверхні МПА розкладають паперові диски, просочені антибіотиком . Їх випускають у промисловості з різними антибіотиками, іноді роблять мультидиски. Облік проводимо по зонах затримки росту або їх відсутні. Діаметр зони визначає ступінь чутливості .