Определение резус-принадлежности крови.

Резус-принадлежность определяется в реакции агглютинации с помощью моноклональных реагентов или аллоиммунных анти-резус сывороток. Метод определения зависит от класса антител в реагенте: если в нем присутствуют полные антитела (класса IgM), то реагент используется для определения резус фактора методом прямой агглютинации в солевой среде; если в нем содержатся неполные антитела (класса IgG), то он используется в непрямом антиглобулиновом тесте, в реакции агглютинации в присутствии высокомолекулярных усилителей (альбумина, желатины и др.), или с эритроцитами, обработанными протеолитическими ферментами.

Независимо от используемого метода определения резус-принадлежности, обязательно проведение следующих контролей:

Ø Со стандартными резус-положительными эритроцитами;

Ø Со стандартными резус-отрицательными эритроцитами.

I. Реакция агглютинации на плоскости с помощью полных анти-D IgM антител.

Определение проводят в помещении с хорошим освещением. Наилучшие результаты тест дает при использовании высокой концентрации эритроцитов и температуре около 37о, поэтому желательно использовать подогретую пластинку. Для исследования используют цельную кровь, отмытые эритроциты, эритроциты в плазме, сыворотке, консерванте или физиологическом растворе.

ü Нанесите большую каплю (около 0,1 мл) реагента на пластинку или планшет.

ü Нанесите рядом маленькую каплю (около 0,03 мл) исследуемой крови (эритроцитов).

ü Тщательно смешайте реагент с кровью чистой стеклянной палочкой.

ü Через 10-20 секунд мягко покачайте пластинку. Несмотря на то, что четкая агглютинация наступает в первые 30 секунд, результаты реакции учитывайте через 3 минуты после смешивания.

ü Запишите результаты реакции немедленно после определения.

При наличии агглютинации исследуемая кровь маркируется как резус-положительная. Если агглютинация очень слабая или отсутствует, у доноров исследование обязательно проводят со вторым реагентом, содержащим IgG (неполные) анти-D антитела (см. пункт III) для уточнения принадлежности такого образца крови к группе Du. У реципиентов выявление Du с помощью неполных антител не обязательно. Следует, однако, иметь в виду, что слабая агглютинация на плоскости может наблюдаться с эритроцитами DuCe. Такому реципиенту нельзя переливать резус-отрицательную кровь, так как это может привести к сенсибилизации против антигена «с». В этом случае целесообразно проверить наличие С антигена у реципиента.

II. Реакция агглютинации с помощью неполных IgG анти-D антител в присутствии высокомолекулярных добавок.

Реакция проводится либо со специально приготовленным реагентом, уже содержащим усилитель (универсальный реагент с полиглюкином или альбумином для плоскости), либо усилитель добавляют в процессе проведения реакции (реакция конглютинации с желатином в пробирке).

1. Техника постановки реакции агглютинации на плоскости не отличается от описанной в пункте I. Однако универсальные реагенты могут давать ложноположительную реакцию с резус-отрицательными эритроцитами за счет содержащихся в них высокомолекулярных веществ, а также могут вызывать агглютинацию эритроцитов, покрытых антителами другой (не анти-резус) специфичности. Поэтому необходимо проведение параллельных тестов с контрольным раствором используемого усилителя, но без анти-D антител. Если контрольный раствор вызывает агглютинацию эритроцитов, то результаты тестирования не достоверны. Повторите определение с другим реагентом.

2. Реакция конглютинации с применением желатина. Для проведения этого теста могут быть использованы моноклональные реагенты и стандартные изоиммунные анти-резус сыворотки с неполными антителами. Необходимо проведение контроля с раствором желатина без анти-резус реагента.

а) Внесите 1 каплю (около 0,05 мл) исследуемой крови или взвеси эритроцитов (примерно 50%) в сыворотке.

б) Добавьте 2 капли (0,1 мл) 10% раствора желатина, предварительно подогретого до разжижения при 46-48°.) Добавьте 2 капли (0,1 мл) реагента анти-D и смешайте.
г) Поместите пробирку в водяную баню при температуре 46-48° на 5-10 минут или в суховоздушный термостат при той же температуре на 30 минут.

д) Долейте в пробирку 5-8 мл физраствора и осторожно 1-2 раза переверните закрытую пробкой пробирку для перемешивания.

е) Определите наличие агглютинатов, просматривая пробирку на свет невооруженым глазом или через лупу.

ж) Немедленно запишите результаты определения.

При положительном результате агглютинаты различимы в виде аггрегатов разной величины на прозрачном фоне - кровь является резус-положительной. При отрицательном результате в пробирке аггрегатов нет, а видна равномерно окрашенная непрозрачная взвесь эритроцитов - кровь является резус-отрицательной. Если наблюдается мелкозернистая вызывающая сомнение агглютинация, то кровь необходимо тестировать в непрямом антиглобулиновом тесте (см. пункт III). Результаты желатиновой пробы являются достоверными только в случае, когда сам желатин сам не вызывает агглютинации исследуемых эритроцитов, а результаты контролей со стандартными эритроцитами соответствуют ожидаемым. В случае неадекватных результатов определение резус-принадлежности следует повторить с использованием другого реагента или другого образца желатина. Если желатин вызывает сам по себе агглютинацию исследуемых эритроцитов, то можно предполагать наличие на них антиэритроцитарных антител анти-резус или иной специфичности (это наблюдается при гемолитической болезни новорожденных, аутоиммунной гемолитической анемии и некоторых инфекционных заболеваниях). В этом случае кровь должна быть направлена на исследование в специальную серологическую лабораторию.

III. Непрямой антиглобулиновый тест (непрямая проба Кумбса) с помощью неполных анти-D антител.

а) Приготовьте 2-5% взвесь трижды отмытых в физиологическом растворе исследуемых эритроцитов. Для этого поместите в пробирку 5 капель (около 0,25 мл) исследуемой крови, трижды отмойте в 5-10 мл физиологического раствора; суспендируйте осадок эритроцитов в 2-3 мл физиологического раствора или, предпочтительнее, в 2-3 мл раствора низкой ионной силы - LISS, в котором фиксация антител на эритроцитах прочнее и происходит быстрее, чем в физиологическом растворе.

б) Внесите 1 каплю анти-D реагента в чистую маркированную пробирку.
в) Добавьте 1 каплю 2-5% взвеси эритроцитов (пункт "а").

г) Инкубируйте смесь при 37о 30-45 минут (если эритроциты в физиологическом растворе) или 10-15 минут (если эритроциты в LISS).
д) Отмойте эритроциты 1 раз (в случае использования моноклонального реагента) или 3 раза (в случае использования иммунной анти-D сыворотки) большим объемом (5-10 мл) физиологического раствора. Однократная отмывка допустима только при использовании моноклональных реагентов. Полностью удалите физиологический раствор.

е) Добавьте к осадку 1 каплю антиглобулинового реагента и тщательно смешайте.

ж) Центрифугируйте 15-20 секунд при 900-1000g (примерно 2000-3000 об/мин).

з) Мягко ресуспендируйте осадок и визуально определите наличие агглютинации.

и) Немедленно запишите результаты определения.

При отсутствии агглютинации кровь считается резус-отрицательной, при положительной реакции - резус-положительной; подгруппы Du могут вызывать слабую агглютинацию даже в этом высокочувствительном тесте. Прежде чем отнести донора Du к резус-положительным, подтвердите заключение контрольным исследованием антиглобулиновой сыворотки со стандартными резус-отрицательными эритроцитами. Если контрольный тест положителен, интерпретация не является достоверной, и кровь такого донора не должна использоваться для трансфузий до окончательного выяснения его резус-принадлежности.

IV. Агглютинация эритроцитов, обработанных протеолитическими ферментами, с помощью неполных анти-D антител.

Неполные антитела способны вызывать прямую агглютинацию в солевой среде эритроцитов, обработанных бромелином, папаином, трипсином и др. протеазами. Этот метод высокочувствителен и надежен при выявлении слабых форм D антигена. Он используется главным образом при автоматическом определении групп крови в системах типа Группоматик, в которых обеспечивается стандартность обработки эритроцитов ферментами и специально подбирается нужное разведение реагента, так как для этого теста характерен феномен прозоны (ингибирование агглютинации избытком антител). При ручном определении групп крови метод может быть использован в специализированных серологических лабораториях в различных модификациях, что не дает возможности его полного описания в этих Методических рекомендациях.