Глава 3. Характеристика объектов и методов исследования

Методы исследований

Определение общей численности микроорганизмов различных биологических групп проводили методом посева на специальные питательные среды:

1. Группы бактерий, выявляемые на плотных средах. Микроорганизмы, использующие органические формы азота, выявляют на мясо-пептонном агаре (МПА;

2. Микроорганизмы (в том числе и актиномицеты), способные использовать минеральные формы азота, чаще выявляют на Пептонно-декстрозном агаре Ваксмана;

3. Микроскопические грибы и дрожжи выявляют на полной дрожжевой среде (ПДС);

4. Азотофиксирующие бактерии выявляют на среде Эшби без азота

Техника посева

Посев на МПА, ПДС и среду Ваксмана проводили методом предельных разведений с последующим высевом полученной суспензии в чашки Петри с соответствующей питательной средой.

Посев выполняется возле горелки при помощи бактериальной петли. Кроме нее, для посева уколом применяют специальную бактериальную иглу, а для посевов на чашках Петри - металлические или стеклянные шпатели. Для посевов жидких материалов наряду с петлей используют пастеровские и градуированные пипетки.

При посеве клеток микроорганизмов из пробирки в пробирку обе пробирки (одну- с культурой, другую – стерильную) берут в левую руку. Одну пробирку зажимают между указательным и средним пальцами (первая пробирка). Нижний конец её свободно лежит на большом пальце (с его левой стороны). Вторую пробирку зажимают между средними и безымянными пальцами. Она должна лежать параллельно первой. Её нижний конец располагается с правой стороны большого пальца [4].

 При работе с пипеткой прежде всего ее освобождают от бумаги или вынимают из пенала, быстрым движением проводят над пламенем горелки, вводят в пробирку и остужают об ее внутреннюю сторону. Затем всасывают посевной материал ртом и, соблюдая описанные выше правила, выдувают его в пробирку или другую лабораторную посуду. Микробную культуру безопаснее всасывать через резиновую трубку или с помощью резиновой груши. Отработанную пипетку опускают в банку с дезинфицирующим раствором. Таким же образом производят посевы пастеровскими пипетками, предварительно обламывая запаянный конец [4].

Приготовление почвенной суспензии и посев

Навеску серозема, равную 1 г, поместили в колбу 250 мл с 99 мл стерильной водопроводной воды, взболтали в течение 10 мин на шейкере и дали отстояться, чтобы осели грубые частицы исследуемой почвы.

Для определения влажности почвы производят отбор исследуемого образца почвы (в нашем случае отобрано 44 г почвы). Пересчёт ведётся на 1 г абсолютно сухой почвы [4]

Колбу с полученной суспензией встряхивают в течение 5 мин. Затем готовят разведения. Стоит обратить внимание, что 1 мл суспензии в колбе соответствует разведению 10^-2. Каждое последующее разведение делают в пробирках с 9 мл стерильной водопроводной воды, следовательно, следующее разведение будет 10^-3, затем 10^-4. Заканчиваем мы разведением 10^-5 [4].

Из каждого предыдущего разведения отдельной стерильной пипеткой берут 1 мл суспензии и переносят в следующую пробирку с 9 мл воды. Каждый раз пипеткой, которой вёлся отбор суспензии, перемешивают саму суспензию 10 раз и откладывают в сторону. Последующие колбы встряхивают около 1 мин. Из полученных разведений делают посев на плотные и жидкие среды [4].

На плотные питательные среды посев проводят поверхностно. Агаризованные питательные среды разливают в стерильные чашки Петри, затем подсушивают в термостате при 40 градусах. На поверхность агаровой пластины стерильной градуированной пипеткой наносят 0,05 мл почвенной суспензии из соответствующего разведения, затем стеклянным шпателем Дригальского растирают каплю досуха [4].

Для глубинного посева берут 1 мл почвенной суспензии и вносят в чашку Петри, заливают разогретым агаром и смешивают суспензию с ним [4].

При учете микроорганизмов почвы в жидких средах последние разливают в пробирки по 9 мл и стерилизуют. Из каждого разведения почвенной суспензии, начиная с самого высокого, отдельной стерильной пипеткой берут по 1 мл и переносят в жидкую среду. Их каждого разведения засевают минимум 2 пробирки [4].

Посев на плотную питательную среду МПА

Состав среды МПА:

МПА - это смесь мясо-пептонного бульона и агара, подщелачиваемая карбонатом натрия. Чтобы приготовить данную питательную среду, нужно к 1 литру бульона добавить 20 г агара. Затем нагреть среду до его растворения и установить слабощелочную реакцию среды, добавив 20-% раствор карбоната натрия. Полученную среду стерилизуют в автоклаве при 120 градусах в течение 20 мин [4].

Из пробирок с 4 и 5 разведением отобрать стерильной пипеткой ровно 1 мл почвенной суспензии, чтобы затем перенести её в чашку Петри. Далее залить суспензию средой мясо-пептонного агара (МПА), которая заранее была расплавлена и остужена до 45 градусов. Чашку Петри со средой и почвенной суспензией аккуратно перемешать. На каждый опыт у нас было две повторности. В итоге у нас получилось 2 чашки Петри с разведением 10^-4 и 2 чашки Петри с разведением 10^-5, которые были помещены в термостат с установленной 30-градусной температурой. Учёт количества колоний микроорганизмов вёлся на основе визуальных наблюдений, который были проведены на 7 день исследования.

Посев на полную дрожжевую среду(ПДС)

Состав среды ПДС:

Для приготовления среды ПДС необходимо к 20 г глюкозы добавить 5 г дрожжевого экстракта и 10 г пептона. К полученной смеси добавляют 20 г агара и 1 таблетку любого антибиотика на 1 л воды [6].

Посев на среду ПДС производился из пробирок с 2 и 3 разведением. Стерильной пипеткой, оттитрованной на 1 мл, взяли аликвоту почвенной суспензии соответствующего разведения и перенесли в чашку Петри, затем залили расплавленной средой ПДС и также аккуратно помешали. Засеянные чашки Петри поместили в термостат с настроенной 30-градусной температурой. На каждый опыт у нас было две повторности. В итоге у нас получилось 2 чашки Петри с разведением 10^-2 и 2 чашки Петри с разведением 10^-3. Учет микроскопических грибов провели на 7-е сутки.

Посев на среду Ваксмана

Состав среды Ваксмана:

Для приготовления данной среды берут глицерин в объёме 3 мл затем к нему добавляют гидроортофосфат калия (1 г/л), нитрат натрия (2 г/л), кристаллогидраты магния и железа(II) в количестве 0,5 и 0,01 г/л соответственно. Хлорид калия добавляется в объёме 0,6 г/л. Микробиологический агар добавляют от 15 до 20 г/л. Затем добавляется 1000 г/л водопроводной воды. Стоит отметить, что рН данной среды должен равнять строго 7. Смесь автоклавируется при 0,5 атм. в течение 20 мин [4].

Посев на данную среду производился из пробирок с разведением 4 и 5. Стерильной пипеткой, которая была оттитрована на 1 мл, отбиралась почвенная суспензия нужного разведения и переносилась в чашку Петри. Далее её заливали питательной средой и аккуратно перемешивали. На каждый опыт у нас было две повторности. То есть в итоге у нас получилось 2 чашки Петри с разведением 10^-4 и 2 чашки Петри с разведением 10^-5, которые были помещены в термостат с установленной 30-градусной температурой. Учёт количества колоний микроорганизмов вёлся на основе визуальных наблюдений, который были проведены на 7 день исследования.