Медиаторы электронного транспорта

ВВЕДЕНИЕ

Задачами аналитических исследований являются определение химического состава и структуры самого широкого круга компонентов, содержащихся в разнообразных веществах и материалах биологического происхождения, а также оценка ряда их физических и физико-химических характеристик.

Данные задачи способствуют созданию простых в применении, недорогих, высокочувствительных и специфичных методов и приборов на их основе для обнаружения заданных веществ в пробе и выполнения химического анализа. Биосенсорные исследования в полной мере удовлетворяют данным требованиям, относятся к области аналитической химии и аналитической биологии и позволяют проводить качественный и количественный анализ.

Основными качествами биосенсорного анализа, принципиально отличающими его от классических вариантов физико-химического, являются:

- безреагентность – для выполнения анализа как правило не требуется производить добавление к исследуемому образцу каких-либо химических реагентов;

- простота анализа – отсутствует необходимость привлечения к его выполнению высококвалифицированного персонала;

- низкая стоимость одиночного анализа, обусловленная малым количеством используемого биологического материала, простотой аппаратурной реализации;

- высокая чувствительность, специфичность – обусловлена применением биологического материала, осуществляющего высокоселективные превращения некоторых веществ; изменяющего свои свойства в присутствии биологически активных соединений; образующего с анализируемым соединением легко идентифицируемые комплексы;

- многократность – возможность длительного измерения образцов без замены рецепторного элемента.

Целью работы является изучение физико-химических и электрохимических закономерностей переноса электронов, что включает в себя расчёт гетерогенных констант переноса электронов с электрохимически активного реагента на поверхностью электрода.

Для достижения цели необходимо решить следующие задачи:

1. Определить электрохимическую обратимость системы.

2. Определить коэффициент переноса.

3. Определитьприроду электродных процессов, лимитирующего тока.

4. Определить гетерогенную константу скорости.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Общие сведения о биосенсорах

Биосенсоры - аналитические устройства, содержащие биологический материал (ткани, клетки микроорганизмов, клеточные рецепторы, ферменты, нуклеиновые кислоты и т.д.), находящийся в непосредственном контакте с физико-химическим преобразователем или преобразующей микросистемой.

Принцип детекции, реализованный в биосенсорах, основан та том, что биоматериал, иммобилизованный на физическом датчике, при взаимодействии с определяемым соединением генерирует зависимый от его концентрации сигнал, который регистрируется преобразователем того или иного типа и после обработки данных представляется в численном виде.

Известно три типа генерации сигнала в амперометрических биосенсорах:

- Электрохимическая регистрация убыли одного из субстратов ферментативной реакции (например, физиологического акцептора электронов – молекулярного кислорода) или образования продукта (в случае, если продукт или субстрат электроактивны).

- Медиаторный перенос электронов (медиаторныйбиоэлектрокатализ).

- Прямой перенос электронов (прямой биоэлектрокатализ). При прямом биоэлектрокатализе транспорт электронов осуществляется непосредственно между электродом и активным центром фермента[1].

Медиаторы электронного транспорта

Первоначально были созданы электроды первого поколения (электрод Кларка), принцип функционирования которых состоял в регистрации изменения концентрации молекулярного кислорода. Биосенсоры первого поколения имели очевидный недостаток, связанный с зависимостью сигналов от концентрации кислорода в среде измерения.

В процессе создания новых типов биосенсоров стало возможным избавиться от нежелательного эффекта, благодаря созданию амперометрических электродов, основанных на прямом переносе электронов в реакциях, катализируемых оксидоредуктазами.

Во втором поколении биосенсоров для передачи электронов из активного центра фермента на электрод стали использовать искусственные акцепторы электронов, способные к обратимому окислению/восстановлению.

Эти молекулы – искусственные доноры или акцепторы электрона (для окисленных и восстановленных форм фермента соответственно) обычно называют медиаторами электронного транспорта. Под медиатором понимается низкомолекулярная окислительно-восстановительная пара, которая переносит электроны от активного центра фермента к поверхности индикаторного электрода. Медиатор могут иммобилизовать наряду с ферментом, возможно применение водорастворимого медиатора, раствор которого для проведения анализа добавляется в ячейку. Фермент вступает в окислительно-восстановительную (редокс) реакцию с субстратом и после восстановления субстратом окисляется медиатором, а не кислородом. Медиатор, в свою очередь, окисляется на электроде.

Использование медиаторов даёт ряд важных преимуществ:

· При условии, что медиатор в восстановленной форме не реагирует с кислородом, результаты измерений становятся практически независимыми от парциального давления кислорода в среде_.  Тем самым устраняется проблема, харак­терная для кислородзависимых биосенсоров, у которых колебания давления кислоро­да влияют на сигнал электрода.

· Сенсоры, содержащие медиаторы, позволяют получать большие величины токов откликов. (Так, если при измерениях с кислородным электродом токи лежат внаноамперном диапазоне, то при использовании медиаторов – в микроамперном).

·  Использование медиаторов позволяет повышать селективность анализа за счет снижения потенциала электрода, который зависит в этом случае только от редокс-потенциала медиаторной пары.

· Если в процессе окисления восстановленного медиатора не участвуют протоны, то медиаторный электрод может быть относительно нечувствителен к изменениям рН среды измерения.

Для использования на практике медиаторы должны отвечать следующим требованиям:

1) Он должен быстро реагировать с восстановленным ферментом;

2) Гетерогенные реакции с его участием должны быть обратимы;

3) Перенапряжение процесса регенерации окисленного медиатора должно быть низким и не зависеть от pH;

4) Медиатор должен быть устойчив как в окисленной, так и в восстановленной форме;

5) Восстановленный медиатор не должен реагировать с O2;

6) Для многих приложений требуется, чтобы медиатор был нетоксичным.

Медиаторы могут принадлежать к самым разным классам соединений, и тем самым демонстрировать разнообразные свойства. Разнообразие структур медиаторов электронного транспорта определяет разнообразие их свойств, а, в частности, редокс-потенциалов. Иногда медиаторы подразделяют на медиаторы природного и синтетического происхождения. К первым относят цитохромы, убихинон, флавопротеины, ферредоксины, витамины (например, витамин K3) и другие. В числе вторых – многие красители (например, метиленовый голубой), фталоцианины, виологены, хиноны, ферроцены, комплексные ионы металлов (например, [Fe(CN)₆]^3-/[Fe(CN)₆]^4-, [Co(NH3)₆]²⁺/[Co(NH₃)₆]³⁺, [Co(bpy)₃] ²⁺/[Co(bpy)₃]³⁺) и др.[2].

Типичными синтетическими медиаторами являются нейтральный красный, 2,6-дихлорфенолиндофенол, метиленовый синий, тионин.

Нейтральный красный:

Нейтральный красный ведет себя отчасти как обратимая система, но в некоторых условиях подвергается второму изменению, которое уже не обратимо. Бесцветная восстановленная форма легко вновь окисляется на воздухе.

Зависимость потенциала нейтрального красного от рН имеет вид:

где K₁ и K₂ – константы, которые относятся к присоединению ионов водорода к двум крайним аминогруппам, а K₀ – подобна диссоциация окисленных форм.

2,6-дихлорфенолиндофенол:

Реакция восстановления2,6-дихлорфенолиндофенола имеет вид:

ДХФИФ в окисленной форме действует как кислотно-основный индикатор: красная окраска в кислом растворе, синяя – в щелочном. Соединение синего цвета имеет максимум поглощения в области 600нм. Восстановленная форма – бесцветна, что позволяет определять концентрацию окисленной формы спектрофотометрически.

Метиленовый синий:

Реакция восстановления метиленового синего имеет вид:

Зависимость потенциала метиленового синего от рН имеет вид:

где K₁ и K₂ – константы щелочной диссоциации иона водорода к каждой аминогруппе.

Тионин:

Реакция восстановления тионинаимеет вид:

Зависимость потенциала тионина от рН имеет вид:

где K₁ и K₂ – константы щелочной диссоциации иона водорода к каждой аминогруппе, K₀ – константа диссоциации иона водорода полярной аминогруппы в окислителе.