Микробиологические нормативы санитарного состояния воздуха

                       производственных помещений (исследуют 1 раз в месяц)

      Задание для самостоятельной работы

1. Провести посев воздуха класса в чашки с МПА методом Коха для определения количества МАФАнМ.
2. Провести посев воздуха класса методом Кротова для определения количества МАФАнМ. Чашки с посевами поставить в термостат.
3. На следующем занятии провести подсчет выросших колоний и определить количество МАФАнМ в 1 м³ воздуха.

  Санитарно-микробиологическое исследование почвы

Цель занятия.Ознакомить студентов с микрофлорой почвы, источниками ее загрязнения патогенной микрофлорой. Студенты должны овладеть различными методами бактериологического исследования почвы.

Материальное оснащение:образцы почвы в пакетиках по 1 г, стерильный физраствор по 9 мл в пробирках, стерильные пипетки по 1 мл, стерильные чашки Петри, расплавленный МПА в пробирках столбиком, пробирки со средой Кесслера , агар Эндо в чашках Петри.

Почва является естественной средой обитания многих видов микроорганизмов. В ней имеются все условия для благоприятного их развития: достаточное количество влаги, органических и минеральных веществ. Почвенные микроорганизмы участвуют в минерализации органических отбросов, самоочищении почвы, в круговороте веществ в природе.

     В почву с выделениями больных, а также с трупами животных, погибших от инфекционных болезней, со сточными водами попадают патогенные микроорганизмы. В связи с этим почва может служить источником распространения возбудителей инфекционных болезней, через почву загрязняются объекты окружающей среды, может происходить обсеменение сапрофитными и болезнетворными микроорганизмами сырья животного происхождения, пищевых продуктов, кормов.

В составе микрофлоры почвы принято выделять так называемые физиологические группы микроорганизмов, которые участвуют в различных процессах и на разных этапах постепенного разложения органических веществ, к которым относятся:

   1. Аммонификаторы, являющиеся гнилостными микроорганизмами, вызывающими гниение остатков растений, трупов животных, разложение мочевины (Bac. subtilis, Bac.mesentericus, S.marcescens, Proteus, грибы рода Aspergillus, Penicillium; анаэробы - Cl.sporogenes Cl.perfringens).

   2. Нитрифицирующие бактерии;

   3. Азотфиксирующие – клубеньковые и свободноживущие азотфиксирующие бактерии обладают исключительной способностью усваивать из воздуха атмосферный азот и в процессе жизнедеятельности образуют из молекулярного азота белки и другие органические соединения азота, которые используются растениями.

   4. Бактерии, расщепляющие клетчатку, вызывающие различные виды брожения, наблюдаемые при разложении микробами органических соединений углерода (молочнокислое, спиртовое, масляное, уксусное, пропионовокислое, ацетонобутиловое и др.).

   5. Бактерии, участвующие в круговороте серы, железа, фосфора.

     На сроки выживания патогенных бактерий в почве оказывают влияние многие факторы: тип почвы, температура, воздействие окружающий экологии.

    К первой группе патогенных микроорганизмов относятся клостридии Cl.perfringens, Cl.botulinum, которые образуют споры и могут попасть с остатками земли в силосуемую массу.

Вторая группа включает спорообразующие патогенные микроорганизмы (возбудители сибирской язвы, столбняка, газовой гангрены), почва для них является вторичным резервуаром, поскольку при благоприятных условиях они могут размножаться и сохраняться в почве длительное время в виде спор. Например, палочки сибирской язвы оказались способными вегетировать в почве при 12⁰ С, достаточной влажности и наличии гумуса и микроэлементов.

В третью группу включены патогенные микроорганизмы, попадающие в почву с выделениями животных и человека и сохраняющиеся там, в течение нескольких недель или месяцев. Все эти микроорганизмы – сальмонеллы, бруцеллы, микобактерии, лептоспиры и т.д. не образуют спор и поэтому быстро гибнут, в результате воздействия различных физических и химических факторов.

В почве обитает много плесневых грибов, некоторые из них, например, грибы из рода Фузариум, Стахиботрис, попадая на злаковые и другие растения, в процессе своего развития, вырабатывают токсические вещества, особенно во время зимовки на полях.

 Обычно ограничиваются определением следующих показателей в почве:

- количество МАФАнМ в 1 г;

- коли-титра почвы;

- в отдельных случаях в почве определяют наличие возбудителей сибирской язвы (например, при строительстве детских лагерей, новых животноводческих помещений).

Отбор проб почвы. На обследуемой территории до 1000 м³ выделяют два участка по 25 м² каждый: один участок выбирают вблизи, другой – вдали от источника загрязнения. С каждого участка отбирают среднюю пробу, составленную из 5 образцов, взятых по диагонали. Образцы берут на глубине до 20 см, при исследовании почвы скотомогильников – ниже глубины захоронения не менее чем на 25 см. Пробы отбирают стерильным железным совком или специальным буром в стерильные широкогорлые банки, которые закрывают ватными пробками. К банке приклеивают этикетку с датой и номером отобранной почвы.

  Масса каждого образца должна быть 200-300 г, а смешанного – не менее 1 кг. Отобранные пробы почвы направляют в лабораторию и исследуют сразу же или не позднее, чем через 12-18 ч при хранении в холодильнике.

    Определение МАФАнМ в 1 г почвы методом серийных разведений

     Для приготовления первого разведения 1:10 в колбу емкостью 500 мл наливают 270 мл стерильной водопроводной воды, куда добавляют 30 г исследуемой почвы. Колбу встряхивают несколько минут и отстаивают для оседания тяжелых частиц, микроорганизмы останутся в верхнем прозрачном слое.

Но в условиях учебного класса обычно 1 г почвы вносят в 10 мл стерильной воды, из полученного разведения почвы 1:10^-1 готовят последующие десятикратные разведения: для чистых почв до 1:10^-4, для загрязненных – до 1:10^-6 - 1:10^-9.

      Из двух последних разведений почвы берут по 1 мл и переносят в стерильные чашки Петри (не менее двух чашек на каждое разведение), которые заливают 15 мл охлажденного до 50⁰С МПА и тщательно перемешивают, (этот метод называется «метод горячих заливок»). Посевы культивируют в термостате 24-48 ч при 30⁰С.

     Учет результатов проводят путем подсчета выросших колоний в чашках Петри и определения среднеарифметического числа. Полученное число колоний умножают на степень разведения исследуемой почвы и получают число бактерий в 1 г почвы. Обычно в 1 г огородной почвы количество бактерий достигает 1-3 млрд.

    Определение коли-титра почвы методом бродильных проб с использованием среды Кесслера. Исследования проводят в три этапа. На первом этапе готовят разведения: для чистых почв от 1:10^-1 до 1:10^-3; для загрязненных – от 1:10^-3 до 1:10^-9. После тщательного перемешивания полученной суспензии из различных разведений по 1 мл переносят в пробирки с 9 мл среды Кесслера с поплавками. Посевы культивируют при 43⁰С в течение 48 часов (при такой температуре дает рост кишечная палочка только теплокровных).

     На втором этапе исследования просматривают посевы на среде Кесслера. Из проросших пробирок с наличием газа делают высев на поверхность агара Эндо в чашках Петри по секторам (4), с таким расчетом, чтобы выросли изолированные колонии. Посевы культивируют при 37⁰С в течение 24 ч.

     На третьем этапе исследуют колонии, выросшие на среде Эндо. Для этого отмечают и отбирают колонии, типичные для бактерий БГКП, готовят из них мазки, красят по Граму, микроскопируют. При обнаружении в мазках коротких грамотрицательных палочек проводят высев из этих колоний на среду Кесслера для подтверждения газообразования в чистой культуре. В таблице 2 приведены санитарно-микробиологические показатели почвы.

Таблица 2

Микробиологические нормативы санитарного состояния почвы

    Особую трудность представляет выделение сибиреязвенных спор из почвы, так как в ней находится огромное количество различных микроорганизмов, в том числе спорообразующих сапрофитных аэробов (Bac.subtilis - сенная палочка, Bac.mesentericus - картофельная палочка, Bac. megatherium - капустная палочка) по многим своим свойствам схожих с палочкой сибирской язвы. Существующие бактериологические методы не всегда позволяют легко выделить возбудителя сибирской язвы из почвы. Основная трудность состоит в отделении спор от частиц почвы. Из многих известных методов более надежным является метод предварительной подготовки пробы почвы по следующей методике: 1.100 г исследуемой почвы заливают 5-10 кратным объемом стерильного фосфатного буфера или воды; 2. Шуттелируют взвесь в течение 20-30 мин, с последующим 5-8 мин отстаиванием; 3. Фильтрование через 2-3 слоя марли; 4. Прогревание полученной суспензии в водяной бане в течение 30 мин при 70⁰С для уничтожения сопутствующей вегетативной микрофлоры; 5. Посев полученной суспензии в МПБ и на поверхность МПА в чашках Петри для получения изолированных колоний; 6.Заражение полученной культурой 5-10 белых мышей, подкожно в дозе 0,1-0,2 мл; 7. Вскрытие павших мышей и выделение чистой культуры возбудителя сибирской язвы.

    Для выделения чистой культуры возбудителя сибирской язвы из исследуемого материала загрязненного посторонней микрофлорой, предложены селективные среды, в состав которых вводят 200-500 ЕД/мл полимиксина в сочетании с триметопримом, которые подавляют рост сопутствующей микрофлоры: мезофильных бактерий, B.subtilis, B.cereus и E.coli.

                         Задание для самостоятельной работы

1. Провести бактериологическое исследование различных образцов почвы методом серийных разведений для определения количества МАФАнМ посевом в чашки Петри. Чашки поставить в термостат.

2. На следующем занятии провести подсчет выросших колоний, определить количество МАФАнМ в 1 г исследуемой почвы.

3. Провести демонстрацию посева исследуемых образцов почвы в среды Кесслера для определения коли-титра.

Санитарно-микробиологическое исследование воды

  Цель занятия. Ознакомить студентов с микрофлорой воды, источниками ее загрязнения патогенной микрофлорой. Студенты должны овладеть различными методами бактериологического исследования воды: определения количества МАФАнМ, коли-титра и коли-индекса воды.

   Материальное оснащение. Пробы речной воды и стерильные пробирки для взятия водопроводной воды; чашки Петри, расплавленный МПА в пробирках столбиком, стерильные пипетки на 1 мл, стерильный физраствор по 9 мл, спирт для факела, пинцет, вата.

    Для демонстрации – прибор Зейтца, водоструйный вакуумный насос, кипяченые мембранные фильтры №3 в стакане с дистиллированной водой, среда Эндо в чашках Петри; глюкозо-пептонная среда (ГПС) с индикатором и поплавками, разлитая по колбам и пробиркам.

Для демонстрации – 3 колбы и 6 пробирок с ГПС с готовыми посевами воды для определения коли-титра воды методом бродильных проб. Только в первой колбе с посевом 100 мл исследуемой воды должно быть помутнение, изменение цвета индикатора (красный цвет индикатора меняется на желтый) и наличие пузырьков газа в поплавках. Агар Эндо в чашках Петри с 4 мембранными фильтрами после фильтрации воды и наличием красных колоний на поверхности белого фильтра.

     Вода является естественной средой обитания многих микроорганизмов. Особую опасность для здоровья человека и животных представляют патогенные бактерии, которые могут быть в воде.

     Источниками загрязнения воды патогенными микроорганизмами являются выделения больных животных и людей, трупы животных, сточные воды, особенно предприятий, перерабатывающих сырье животного происхождения и др. Длительность выживания патогенных микробов в воде зависит от их вида, условий окружающей среды и может составлять от нескольких часов до нескольких лет. Так, возбудитель сибирской язвы может сохраняться в воде до 3 лет, возбудитель туберкулеза до 1 года, а бруцеллы - до 100 дней. Имеется группа болезней, для которых характерен водный путь распространения (паратифы, лептоспирозы).

  Таким образом, вода может стать источником распространения инфекционных болезней и возникновения эпидемий и эпизоотий.

   Для санитарно-микробиологической оценки воды проводят следующие исследования:

   1.Определение количества МАФАнМ в 1 мл воды;

   2. Определение коли-титра (КТ) и коли-индекса (КИ);

   3. Обнаружение в воде патогенных микроорганизмов по эпидпоказаниям.

    При санитарно-микробиологических исследованиях пробы воды забирают в объеме не менее 0,5 л. Из открытых водоемов пробу воды отбирают батометром. Батометр – стерильная емкость с пробкой, в металлическом каркасе и свинцовым грузилом. На нужной глубине пробку открывают, подтягивая ее за веревочку. Воду из рек, озер отбирают с глубины 10-15 см от поверхности, а при небольшой глубине на расстоянии 10-15 см от дна.

   Для отбора проб водопроводной воды из крана используют стерильные колбы на 0,5 л с ватной пробкой. Кран предварительно стерилизуют обжиганием, горящим спиртовым тампоном, затем в течение 10 мин спускают воду. Пробы воды исследуют тотчас же или не позднее 2 ч с момента взятия. Если это невозможно, то хранят не более 6 ч при 1-5⁰ С.

    Определение количества МАФАнМ в водопроводной воде. В чашку Петри с соблюдением правил асептики вносят 1 мл водопроводной воды без разведения, заливают 15 мл расплавленного и охлажденного до 45⁰С МПА. Посевы инкубируют в термостате при 30⁰С 72 ч. Количество бактерий в 1мл воды определяют по количеству выросших колоний.

    Для определения количества МАФАнМ в воде открытых водоемов  исследуемую воду в зависимости от предполагаемого загрязнения предварительно разводят стерильной водой от 1:10^-1 до 1:10^-4, из двух последних разведений по 1 мл вносят в стерильные чашки (не менее 2 чашек на каждое разведение) и заливают 15 мл расплавленного и охлажденного до 46⁰С МПА. Посевы помещают в термостат при 30⁰С на 72 ч, подсчитывают количество колоний, умножают на степень разведения и определяют количество бактерий в 1 мл воды открытых водоемов.

    Определение коли-титра (КТ) и коли-индекса (КИ) воды.

    Коли-титром называют наименьший объем воды, в котором обнаружена одна кишечная палочка.

     Коли-индекс показывает число кишечных палочек в 1000 мл воды.

     Кишечная палочка является постоянным обитателем кишечника человека и животных, следовательно, ее присутствие в питьевой воде является индикатором фекального загрязнения. Чем выше концентрация бактерий группы кишечной палочки, тем вероятнее присутствие таких бактерий, как сальмонеллы, возбудители дизентерии и холеры. Показатели КТ и КИ указывают на санитарное состояние воды, ее пригодность в качестве питьевой. КТ и КИ определяют двумя методами:

   1.Метод бродильных проб.

   2.Метод мембранных фильтров.

                                 Метод бродильных проб

Этот метод основан на ферментативной активности бактерий группы кишечной палочки (БГКП), которая выражается в способности расщеплять при помощи ферментов лактозу или глюкозу до кислоты и газа. Исследуемая вода засевается в различных объемах в среду накопления - глюкозо-пептонную среду (ГПС) с индикатором и поплавками. При наличии кишечной палочки появляется помутнение, меняется цвет индикатора, и появляются пузырьки газа в поплавках. Из забродивших посевов делают пересев на дифференциально-диагностические среды.

Методика: засевают водопроводную воду в объеме 333 мл, разделенной на 9 порций (три объема по 100 мл, три – по 10 мл и три - по 1 мл). При этом вода в объемах по 100 мл засевается в три колбы с 10 мл концентрированной ГПС, 10 мл - в три пробирки с 1 мл концентрированной среды, а 1 мл воды вносят – в пробирки с 10 мл среды с нормальной концентрацией. Посевы инкубируют в термостате 24 часа при 37⁰С. При отсутствии БГКП в исследуемой воде, изменение цвета индикатора и образование газа не происходит

  Рост кишечной палочки сопровождается помутнением среды, изменением цвета индикатора (красный цвет переходит в желтый) и появлением газа в поплавках. Из колбы и пробирок с признаками роста проводят пересев на агар Эндо штрихом по секторам. Посевы инкубируют при 37⁰С 24 часа. При отсутствии роста на агаре Эндо или при наличии колоний, не характерных для БГКП, дается отрицательный ответ.

  Из колоний, характерных для бактерий БГКП (ярко-красных с металлическим оттенком, розовых), готовят мазки, их окрашивают по Граму, микроскопируют. Дополнительно изучают культуру по оксидазному тесту. Для этого на фильтровальную бумагу пропитанную раствором альфа-нафтола-диэтил-n-фенилендиамина наносят штрихом 2-3 колонии снятые с агара Эндо.

  Для кишечной палочки характерно: наличие грамотрицательных палочек в мазке и отсутствие изменений в окраске фильтровальной бумаги на оксидазный тест. Следовательно, наличие грамотрицательных палочек и отрицательный оксидазный тест подтверждает наличие кишечной палочки в исследуемой воде.

Для подтверждения свежего фекального загрязнения исследуемой воды посевы выращивают при 43⁰С для дифференциации от кишечных палочек хладнокровных, не растущих при такой высокой температуре. Требования к санитарному состоянию воды приведены в таблице 3.

                                                                                                Таблица 3

Микробиологические нормативы санитарного состояния воды

Из таблицы видно, что для питьевой воды установлены следующие нормативы бактериологических показателей:

- общее микробное число – не более 100 в 1 мл;

- коли-титр - не менее 333;

- коли-индекс не должен превышать 3 кишечных палочек в 1000 мл.

    Вода открытых водоемов считается доброкачественной, если общее микробное число – не более 1000 в 1 мл, коли-титр – не менее 111, коли-индекс – не более 9.

                        Метод мембранных фильтров

   Для исследования воды применяется мембранный фильтр №3 из нитроцеллюлозы, с диаметром пор 0,7 мкм, который задерживает на своей поверхности БГКП. Перед использованием мембранные фильтры кипятят 10-15 мин в дистиллированной воде. Фильтр, с соблюдением правил асептики, матовой поверхностью вверх накладывают на сетку фильтрационного прибора Зейтца. В воронку прибора наливают исследуемую воду и в приемной колбе Бунзена создают вакуум при помощи водоструйного насоса. Исследуемую воду фильтруют через мембранный фильтр, а бактерии, находившиеся в ней, остаются на поверхности. После фильтрации мембранный фильтр матовой стороной вверх переносят на поверхность агара Эндо в чашках Петри. Чашки ставят в термостат при 37⁰С на 18-24 ч.

  Через поры мембранного фильтра происходит диффузия питательных компонентов среды Эндо, вследствие этого оставшиеся на поверхности БГКП размножаются на поверхности фильтра и образуют типичные колонии - красные с металлическим оттенком. По числу выросших колоний определяют количество кишечных палочек в 1000 мл воды и тем самым устанавливают коли-индекс.

  Водопроводную воду исследуют в объеме 333 мл, которую дробно и последовательно пропускают через четыре фильтра в объемах - 200, 100, 30 и 3 мл воды.

   Наличие в воде патогенных бактерий устанавливают путем посева на дифференциально-диагностические и селективные питательные среды с последующей их идентификацией методами, принятыми в микробиологии.

      Задание для самостоятельной работы

1.Провести посев водопроводной и речной воды в чашки Петри для определения количества МАФАнМ.

2.На следующем уроке подсчитать число выросших колоний в чашке Петри и определить МАФАнМ исследуемой воды.

3.Провести демонстрацию посева водопроводной воды для определения коли-титра воды методом бродильных проб и коли-индекса методом мембранных фильтров.

4.Определить коли-титр и коли-индекс по демонстрационным посевам исследуемой воды в колбы и пробирки с ГПС.