Компенсация дефектов митохондрий.

Оказалось, что слияние и деление митохондрий очень важны для клетки: их нарушение неминуемо приводит ее к гибели. Белки, участвующие в этих процессах, к настоящему времени неплохо описаны. У млекопитающих в делении митохондрий участвуют белки Fis1 и Dlp1, а в слиянии — белки Mfn1 и Mfn2 (во внешней мембране), Opa1 (во внутренней). Но что кроется за такой динамикой и почему эти процессы так необходимы? С делением все вроде понятно, но для чего нужно слияние? Оно необходимо для поддержания достаточного количества энергии в клетке: большие митохондрии с множеством крист, вероятно, дадут клетке больше энергии. При слиянии дефекты одной митохондрии компенсируются за счет другой, нормальной. Такой процесс называется митохондриальной комплементацией. В 2001 г. в ходе оригинальных экспериментов, проведенных в лаборатории Дж.И.Хауаши, установили, что после слияния клеток с разными патогенными мутациями мтДНК (одноклеточная линия с мутацией A4269G в тРНК лизина, другая – с мутацией A3243G в тРНК лейцина), в гибридных клетках работа дыхательной цепи митохондрий восстанавливалась. Эти мутации нарушают трансляцию митохондриальных белков, и потому значительно уменьшается выработка энергии в митохондриях. После слияния в митохондриях гибридных клеток наблюдали оба варианта мтДНК. Интересно, что в более ранних работах (1994), выполненных в лаборатории Дж. Аттарди, где также сливали клеточные линии, содержащие патогенные мутации признаков митохондриальной комплементации не обнаружили. По мнению Аттарди, подобное разногласие вызвано тем, что в его экспериментах клетки одной линии предварительно энуклеировали  и гибридная клетка после слияния содержала лишь ядерный геном второй клеточной линии, тогда как в работе Хауаши клетки после слияния имели гибридный ядерный геном. В 2001 г. японские исследователи под руководством К. Накада продемонстрировали тот же эффект на мышиных моделях. Они создали линию mito mouse, в которой мтДНК содержала делецию протяженностью 4696 пар нуклеотидов. Анализируя ткани таких мышей, исследователи не обнаружили в пределах одной клетки сосуществования нормальных и дефектных митохондрий и интерпретировали этот факт как митохондриальную комплементацию. Однако через четыре года американской команде под руководством Д.Прокоп удалось показать, что митохондрии способны компенсировать свои дефекты без предварительного слияния клеток. Исследователи совместно культивировали клетки с дефектными митохондриями, не способными к самостоятельному росту, и стволовые клетки с нормально функционирующими митохондриями. После изоляции первых клеток и их отдельного культивирования обнаружили трехкратное повышение выработки АТФ, пониженную концентрацию уровня молочной кислоты и активных форм кислорода, но при этом увеличение мембранного потенциала и семи кратное потребление кислорода. Согласно молекулярному анализу, в этих клетках присутствовала мтДНК стволовых клеток, а анализ ядерных маркеров не выявил наличия чужеродной ДНК. Полученные результаты авторы интерпретируют весьма осторожно как возможный переход митохондрий из клетки в клетку либо как переход мтДНК одних клеток в митохондрии других (без перемещения всей органеллы). Механизм миграции митохондрий между клетками (если таковой имеется) до сих пор неясен, однако есть предположения о прямом цитоплазматическом транспорте либо о везикулярном. В целом, митохондриальная комплементация, вероятно необходима для поддержании гомеостаза на внутриклеточном и тканевом уровнях. Что происходит после слияния — вопрос, который к настоящему времени лишь начинаю изучать. Возможно, после слияния митохондрий их ДНК взаимодействуют. Известно, что мтДНК связана с определенными белками и образует с ними комплексы, получившие название нуклеоиды. В зависимости от типа клеток в состав одного такого нуклеотида  может входить от 1 до 10 молекул ДНК. В 2000 г. группа финских ученых под руководством профессора Х. Якобса выдвинула так называемую гипотезу стойких нуклеотидов, согласно которой ДНК разных митохондрий после слияния никогда напрямую не взаимодействуют. Их концепция основывалась на имеющихся к тому времени экспериментальных данных и позволяла отчасти объяснить поведение мутантных мтДНК. Но через четыре года американские ученые во главе с Дж. Манфреди предложили гипотезу динамичных нуклеотидов, согласно которой мтДНК одной митохондрии способна контактировать с мтДНК другой и обмениваться с ней фрагментами (рекомбинировать). Для подтверждения своей гипотезы они слили две клеточных линии: одну с мутацией мтДНК G6930A и другую с делецией 14787 14790. В результате гибридные клетки восстанавливали дыхательную активность, а в их митохондриях присутствовала мтДНК, явно получившаяся в ходе рекомбинации исходных молекул (рис.3).

В 2008 г. другая группа американских исследователей, лидер которой Э. Шон, экспериментально установила, что после слияния митохондрий их ДНК все-таки объединяются в один нуклеотид, но настолько редко, что модель стойких нуклеотидов описывает эффект компенсации более точно. Такой вывод авторы сделали исходя из следующего хитроумного эксперимента: они слили две клеточных линии, мтДНК которых имела делеции 7846-9748 и 10155-15945 соответственно. Популяции этих вариантов мтДНК отличали друг от друга с помощью цветных меток FISH: зеленой, комплементарной участку мтДНК с одной делецией, и красной — с другой. Гибридные клетки светились так, как если бы их митохондрии содержали оба варианта мтДНК, но в составе разных нуклеотидов. Клетки, которые совместно культивировали, но не сливали, имели разную окраску. После слияния в клетках восстанавливался митохондриальный белковый синтез. Интересно, что лишь на 274й день эксперимента в гибридных клетках все таки удалось обнаружить свечение, интерпретируемое как обмен мтДНК между нуклеотидами. Авторы заключили, что митохондриальная комплементация происходит на уровне митохондриальных белков, которые синтезируются независимо с каждого нуклеотида, расположенного вне посредственной близости друг от друга после слияния.

Наследование митохондрий.

У млекопитающих митохондрии передаются строго по материнской линии, поскольку в сперматозоидах они после оплодотворения уничтожаются. Далее рассматривается судьба только женских митохондрий. В яйцеклетке 150—200 тыс. митохондрий и количество мтДНК колеблется примерно в этом же диапазоне. Отсюда следует, что каждая митохондрия содержит одну две молекулы мтДНК. В 2003 г. Х. Чен с коллегами по косвенным данным установили, что на ранних стадиях развития эмбриона слияние митохондрий отсутствует, а это, в свою очередь, препятствует митохондриальной комплементации. Кроме того, наличие лишь одной,    двух молекул мтДНК в митохондрии обеспечивает более яркое фенотипическое проявление ее мутаций. Вероятно, это позволяет очистить пул митохондрий от дефектных собратьев, которые узнаются и уничтожаются специальными клеточными структурами — митофагами, играющими в клетке роль мусорщиков. Возможно также, что остановка слияния митохондрий на ранних стадиях развития эмбриона препятствует обмену мтДНК между митохондриями яйцеклетки и сперматозоидов, в которых митохондрии остаются в зиготе после оплодотворения до 8 клеточной стадии. Отсутствие рекомбинации между мтДНК яйцеклетки и сперматозоида, по мнению Уоллес, крайне необходимо для поддержания устоявшегося варианта материнской мтДНК, который постоянно подвергается естественному отбору как единая группа сцепления. Установлено, что, несмотря на множество копий мтДНК в яйцеклетке, уже к следующему поколению они представлены новыми вариантами. Это позволило выдвинуть концепцию прохождения мтДНК через бутылочное горлышко на одной из стадий развития. Действительно, последующие ультраструктурные исследования показали, что до оплодотворения в зрелой яйцеклетке примерно 200 тыс. митохондрий. После оплодотворения в результате серии зиготических делений (но без деления митохондрий) пул последних уменьшается с каждым клеточным делением вдвое. Бластоциста содержит примерно 1 тыс. митохондрий, т.е. около 100 митохондрий на бластомер. После имплантации, в ходе дальнейшей дифференциации клеток, обособляются первичные половые клетки, гоноциты. Эти первые в линии зародышевого пути клетки сначала скапливаются в энтодерме желточного мешка, а затем мигрируют через мезенхиму в зачатки гонад. До миграции каждый гоноцит содержит примерно 10 тыс. митохондрий. Таким образом, митохондрии, которые участвуют в формировании предшественников половых клеток, составляют лишь малую часть (0.01%). Однако после миграции количество митохондрий увеличивается до 100, затем, в оогониях, до 200, а в примордиальных фолликулах — до 5 тыс. После наступления половой зрелости, в ходе созревания яйцеклетки, количество митохондрий в ней увеличивается до 2т всего изначального пула митохондрий зиготы. Видимо, прежнее количество митохондрий, характерное для зрелой яйцеклетки, восстанавливается за счет некоторых субпопуляций митохондрий примордиальных фолликул. Однако к единому мнению по этому вопросу исследователи так и не пришли, что порождает дебаты на страницах высокоимпактных научных журналов. Как уже отмечалось, такое изменение численности митохондрий получило название бутылочного горлышка или генетической воронки.(рис.4).

Первый термин отражает количественное изменение числа митохондрий при их наследовании. Второй термин, на наш взгляд, более адекватен, так как говорит об уменьшении генетического разнообразия вариантов мтДНК. Это имеет первостепенное значение для качества митохондрий и, следовательно, для здоровья клетки. Существование нескольких независимо мутирующих копий мтДНК в составе одной митохондрии приводит к гетероплазмии, т.е. к состоянию, когда в одной митохондрии, клетке или органе сосуществуют несколько вариантов мтДНК (в отличие от гомоплазмии, при которой все мтДНК идентичны). Поскольку в мтДНК закодирована информация о структуре ферментов, участвующих в выработке энергии, то и количество вырабатываемой митохондриями энергии при гетероплазмии тоже разное. Из-за резкого уменьшения количества митохондрий (примерно в 20 тыс. раз) в клетке сильно сокращается разнообразие мтДНК, а вкупе с механизмом уничтожения дефектных митохондрий это должно обеспечивать передачу следующему поколению только правильно работающих митохондрий. 

ЧастьII

Митохондриальные болезни.

Мутации в мтДНК могут нарушать выработку энергии и в конечном счете вызывать гибель клетки. Хотя нормально работающие митохондрии способны при слиянии компенсировать дефекты своих собратьев, и имеется барьер, препятствующий наследованию дефектных митохондрий, в реальной жизни дефектные митохондрии все же существуют. Более того, они могут накапливаться, что губительно действует на клетку. Подобные нарушения специализированных клеток различных тканей и органов человека приводят к различным патологическим состояниям. О том, что нарушения выработки энергии в форме АТФ могут быть причиной некоторых нейромышечных синдромов, известно  c  1962 г. Однако причинно следственную связь между известными заболеваниями и мутациями в мтДНК обнаружили лишь три десятилетия спустя. В настоящее время активно развивается митохондриальная медицина, задача которой заключается в поисках путей лечения больных митохондриальными заболеваниями. Сегодня установлено, что такие болезни поражают одного из 10 тыс. жителей планеты, но носителей патогенных мутаций мтДНК значительно больше. Кроме того, дефекты митохондрий выявляются при нейродегенеративных состояниях, таких как болезни Альцгеймера, Паркинсона, Гентингтона и боковой амиотрофический склероз; изменения в мтДНК наблюдаются в раковых клетках, а также при старении организма. При митохондриальных заболеваниях страдают в первую очередь наиболее энергозависимые ткани и органы, т.е. нервная и мышечная ткани, что и отражено в термине «энцефаломиопатия» (от лат. enchephalos —головной мозг, а myos — мышцы), а также любые органы и ткани. В некоторых случаях сочетание пораженных органов крайне удивительно и труднообъяснимо. Например, при болезни Лебера потеря зрения в некоторых случаях сочетается с нарушением проводимости сердца. Термин «нейродегенеративные заболевания» также подчеркивает тот факт, что в основе патогенеза лежит дегенерация нервной ткани. Нервные клетки погибают «изнутри», в результате апоптоза (программируемой клеточной смерти).

Начинается апоптоз именно в митохондриях, когда они по тем или иным причинам не вырабатывают достаточного количества энергии для поддержания жизнедеятельности клетки. Несмотря на то, что митохондриальными заболеваниями в первую очередь считают патологии, вызванные мутациями мтДНК, мутации ядерных генов, отвечающих за биогенез митохондрий, могут приводить к таким же наследственным болезням. Для описания первых обычно применяют классификацию, основанную на том, какую область мтДНК затрагивает мутация: область структурных генов и генов рРНК и тРНК, а также перестройки, затрагивающие большие сегменты мтДНК. Дефекты ядерной ДНК значительно разнообразнее: они включают как мутации генов системы окислительного фосфорилирования и аппарата белкового синтеза в митохондриях, так и мутации генов системы импорта/экспорта в митохондрии, их движения, слияния/деления, транскрипции и репликации мтДНК, а также мутации генов различных ферментативных циклов(цикла трикарбоновых кислот, β окисления жирных кислот)  и других метаболических путей, связанных с функционированием митохондрий . В силу специфики диагностика митохондриальных заболеваний весьма запутана и трудоемка , но можно выделить пять блоков, составляющих основные этапы диагностики (табл.1).

К основным митохондриальным заболеваниям можно отнести 15 нозологических форм, диагностические критерии которых сегодня четко сформулированы. Выявлены также гены, чаще всего подверженные патогенным мутациям (табл.2).

Наблюдаемое разнообразие клинических симптомов митохондриальных заболеваний, вызванных мутациями мтДНК, формируется за счет таких факторов, как гетероплазмия, пороговый эффект и эффект бутылочного горлышка(генетической воронки). Предполагается, что при делении клеток эмбриона митохондрии расходятся случайно, поэтому гетероплазмия имеет уникальный характер распределения. На основе гипотезы стойкого нуклеотида американские исследователи Э. Шони, Р. Гилкерсон в 2008 г. предложили модель, объясняющую уровень гетероплазмии мтДНК. Модель рассматривает самый простой и наиболее часто встречаемый для патогенных мутаций вариант гетероплазмии, состоящей из мтДНК нормального и дикого типов. Митохондриальные ДНК (мутантная и дикого типа) могут входить в один нуклеотид либо составлять отдельные нуклеотиды в одной митохондрии. Если материнская клетка содержит гетероплазматические нуклеотиды, колебание уровня гетероплазмии дочерних клеток незначительно, но, если в материнской клетке присутствуют гомоплазматические нуклеотиды, уровень гетероплазмии дочерних клеток различается весьма значительно и зависит, как полагают авторы, от отбора и генетического дрейфа. Установлено, что уровень гетероплазмии в митохондриях при первых трех зиготических делениях (стадия 8 клеточного зародыша) остается постоянным во всех бластомерах. Вероятно, это связано с тем, что клетки до стадии 8 клеточного зародыша тотипотентны и лишь с 16 клеточной стадии зародыша начинается их первая дифференцировка (на клетки трофобласта и клетки зародышевой массы). Можно предположить, что именно тогда включается митохондриальная митотическая сегрегация, т.е. случайное распределение митохондрий между дочерними клетками. Выключение этого процесса, вероятно, происходит на стадии созревания яйцеклетки, поскольку показано, что в яйцеклетке и в полярном тельце уровень гетероплазмии одинаковый. Высказывается также мнение, что митотическая сегрегация является постгаструляционным событием. Интересно, что мутации в состоянии гомоплазмии чаще приводят к поражению одного органа, а в состоянии гетероплазмии — к поражению нескольких органов и тканей . Возможно, тканеспецифичное распределение мутации связано с тканеспецифическим составом митохондрий, поскольку установлено, что структура митохондрии отчасти тканеспецифическая, т.е.около половины белкового состава органеллы консервативно(аппарат поддержания мтДНК, комплексов окислительного фосфорилирования, а также ферменты некоторых метаболических путей), в то время как другая половина может меняться в зависимости от типа клеток. Одно из захватывающих направлений митохондриальной биологии — митохондриальная теория старения, которую предложили еще в 1956 г.  к настоящему времени ее не подтвердили и не опровергли, но она обросла новыми фактами как «за», так и «против». Согласно этой теории, начиная с рождения и в течение жизни человека в его мтДНК накапливаются мутации. Вследствие этого митохондрии вырабатывают все меньше и меньше энергии, клетки потихоньку отмирают, а организм дряхлеет. Известно, что основной источник мутаций мтДНК — это активные формы кислорода. Как полагают, уменьшение их количества в митохондриях снижает число вновь образующихся мутаций мтДНК и таким образом продлевает жизнь клеткам, увеличивая тем самым продолжительность жизни организма.