УИРС. Исследование амилазной активности мочи.

Исследование амилазной активности мочи по Вольгемуту производится аналогично методике приведенной выше для определения активности амилазы слюны). Амилазная активность мочи также отражает и величину клубочковой фильтрации. Снижение активности этого фермента в моче наблюдается при почечной недостаточности. В норме амилазная активность мочи по Вольгемуту составляет от 16 до 64 Е.

Для определения активности амилазы можно использовать также модификацию Бюхнера. По данному методу амилазная активность мочи выражается количеством фермента, расщепляющим 2 мг крахмала за 15 мин.

Ход работы.На сухую чашку Петри заранее капают в разных местах по 1 капле раствора Люголя (всего 8-10 капель). В пробирку вносят 2 мл 0,1% р-ра крахмала (2 мг крахмала), 1 мл физиологического р-ра и помещают пробирку на водяную баню при 37°С на 2 мин. Через 2 мин, не вынимая пробирку из бани, добавляют в нее 05 мл мочи, перемешивают и отмечают время начала реакции. Затем каждые 2-3 мин переносят каплю реакционной смеси на чашку Петри в раствор Люголя до тех пор, пока не произойдет полное разложение крахмала, т.е. до появления желтого цвета   

Активность амилазы рассчитывают по формуле:

Х_ед=15/Т×0,5,

где  х- активность амилазы в 1 мл мочи;

15 – время, необходимое для полного расщепления 2 мг крахмала;

0,5 – количество мочи, взятое на анализ, мл;

Т- время реакции, мин.

В норме активность амилазы мочи по Бюхнеру составляет 1-2 ЕД.

Эталоны ответов к тестовым заданиям

Вид 1. 1.1. – в; 2 –а.

Вид 2. 2.1. 1-В; 2-г; 3-а; 4-д; 5-б; 

2.2. 1-а; 2-б; 3-в;

2.3. 1-е; 2- а, б; 3-г; 4-г; 5-д; 6-а, б, в.

Вид 3.3.1.- 4; 3.2.- 1,2,3.

Вид 4.4.1.- А (+, +, +); 4.2.- С (+, -, -).

Эталоны ответов на ситуационные задачи

Задача 1.Молярная активность (число оборотов) – это количество молекул субстрата, превращаемое одной молекулой фермента за единицу времени. Молярная активность выражается в единицах Кат/г-моль фермента, либо Е/мкмоль фермента. Таким образом, молярная активность лактатдегидрогеназы составляет 9,6:0,002=4,8∙10³ мин^-1.

Задача 2.Катал – количество фермента, преобразующее моль субстрата в секунду (моль/сек). Активность фермента составляет 5 нКат, т.е. фермент преобразует 5•10 ^-9 моль субстрата в сек, следовательно, за 20 секунд - 5•20•10 ^-9 = 1•10 ^-7моль субстрата. Для перевода в граммы умножим эту величину на молярную массу субстрата (исходя из формулы ν=m/Mr):

1 •10 ^-7•672=672•10 ^-7грамм субстрата.

Задача 3.Для инфаркта миокарда характерно увеличение сывороточной активности ферментов аминотрансфераз – аспарагиновой и аланиновой), лактатдегидрогеназы (изофермент ЛДГ₁), креатинкиназы 2 (изофермент-МВ). Определение активности этих ферментов поможет в подтверждении диагноза.

Занятие № 8. Зачетное занятие по модулю «Белки. Ферменты».

Цель занятия: проверить и закрепить знания студентов о белках, ферментах и методах их анализа, имеющих значение для клинической медицины.

Содержание занятия.Студентам предстоит пройти компьютерное тестирование, дать письменные ответы на контрольные вопросы и пройти индивидуальное собеседование с преподавателем.

Контрольные вопросы к модулю «Белки. Ферменты»

1. Общая характеристика, элементарный состав, история изучения белков. Формирование представления о белках как о классе соединений и важнейшем компоненте живых  организмов. Исследования Мульдера, Данилевского, Фишера и др.

2. Структура, свойства, классификация и общая характеристика протеиногенных аминокислот.

3. Первичная структура белков (умение писать структуры пептидов). Зависимость биологических, свойств белков от первичной структуры. Методы исследования первичной структуры.

4. Конформация пептидных цепей в белках (вторичная, надвторичная и третичная структуры). Слабые внутримолекулярные взаимодействия в пептидной цепи; дисульфидные связи.

5. Четвертичная структура белков. Кооперативные изменения конформации протомеров на примере гемоглобина, аллостерических ферментов.

6. Биологические функции белков. Способность к специфическим взаимодействиям. И пецифическое узнавание как основа биологических функций всех белков. Комплементарность структуры центра связывания белка и лиганда; зависимость связывания от концентрации лиганда.

7. Глобулярные и фибриллярные  белки. Пространственные конфигурации (α-кератиновая, β-кератиновая) фибриллярных белков, их свойства.

8. Общая характеристика физико-химических свойств белков. Растворимость и осаждаемость белков. Факторы стабилизации белковой молекулы в растворах.

9. Высаливание белков. Высаливающие агенты. Механизм высаливания. Практическое использование высаливания.

10. Денатурация белков. Факторы, механизм, практическое использование денатурации белков.

11. Электрические свойства белков. Механизм возникновения электрического заряда белков. Изоэлектрическая точка. Электрофоретическое разделение белков сыворотки крови на бумаге, протеинограмма здорового человека.

12. Количественные методы определения белка. Определение белка крови биуретовым методом. Нормальное содержание белка крови. Гипо-,  гиперпротсинемия. Белковый коэффициент крови.

13. Принципиальная схема устройства и работа фотоэлектроколориметра (ФЭК). Способ определения концентрации веществ с помощью калибровочного графика.

14. Принцип метода диализа, его практическое значение.

15. Классификация белков. Простые белки: общая характеристика альбуминов, глобулинов, гистонов, протаминов и глутелинов.

16. Сложные белки, общая характеристика, классификация..

17. Нуклеопротеины – строение, классификация, биологическая роль. Уровни упаковки ДНК в составе хроматина. Строение простетической группы нуклеопроетинов – понятие о нуклеиновых кислотах, отличия ДНК от РНК.

18. Собственно гликопротеины. Классификация. Характеристика простетической группы гликопротеинов – классификация, структура, химические свойства углеводов. Гликопротеины слизей.

19. Гликопротеины плазмы крови. Методы их исследования. Биологическая роль отдельных представителей (трансферрин, гаптоглобин, церрулоплазмин, транскортин, урогликопротеиды и др.).

20. Протеогликаны. Строение простетической группы – гликозаминогликанов. Принцип построения протеогликановых комплексов, цементирующая роль гиалуронвой кислоты.

21. Понятие о мукополисахаридозах или болезнях накопления гликозаминогликанов в тканях.

22. Хромопротеины, Общая характеристика железосодержащих хромопротеинов.

23. Строение гемоглобина. Формы гемоглобина (Нb А, Нb Р, Hb F, Hb S). Понятие о гемоглобинопатиях.

24. Производные гемоглобина. Схема строения окси-, карб-, карбокси- и мет-гемоглобина. Условия образования гемоглобина. Помощь при отравлении угарным газом и метгемоглобинемии.

25. Липопротеины. Общая их характеристика. Биологическая роль.

26. Липопротеины сыворотки крови. Строение. Методы разделения. Характеристики отдельных фракций (хиломикроны, ЛПОНП, ЛПНП, ЛПВП). Аполипопротеины.

27. Строение и свойства биологических мембран (криссталичность, жидкостность, ассиметричность, текучесть). Типы переноса веществ через биомембраны.

28. Липосомы, как модельная система биомембран, их применение в медицине.

29. Что такое ферменты? История развития учения о ферментах.

30. Общие свойства ферментов. Какие опыты позволяют их обнаружить. Сходства и отличия ферментов и неорганических катализаторов.

31. Химическая природа ферментов. Ферменты-протеиды и ферменты-протеины. Что такое кофактор, апофермент, холофермент, активный и аллостерический центры.

32. Химическая природа кофакторов и коферментов.

33. Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры, рН, концентрации фермента, графическое изображение зависимости. Термостабильные и термолабильные ферменты.

34. Константа Михаэлиса, ее вывод и физический смысл.

35. Зависимость ферментной реакции от концентрации субстрата. Уравнение Михаэлиса-Ментен. График зависимости. Анализ уравнения Михаэлиса-Ментена. (различные соотношения S м Км). Уравнение Лайнуивера-Берка его графическое выражение.

36. Активаторы ферментов, типы их действия.

37. Ингибиторы ферментов. Специфические и неспецифические, обратимое и необратимое, конкурентное и неконкурентное, ингибирование.

38. Механизм действия ферментов. Влияние ферментов на энергию активации реакции. Механизм действия холинэстеразы.

39. Номенклатура и классификация ферментов. Характеристика отдельных классов и подклассов ферментов. Цифровой шифр ферментов.

40. Единицы выражения активности ферментов.

41. Изоферменты. Значение определения изоферментов в медицинской практике. Изоферменты лактатдегидрогеназы, креатинфосфатазы, щелочной фосфатазы.

42. Понятие о мультиферментных комплексах.

43. Энзимодиагностика различных заболеваний.

44. Понятие и примеры энзимопатий.

45. Понятие о энзимотерапии в медицинской практике.

46. Иммобилизованные ферменты (ИФ). Понятие об инженерной энзимологии. Применение ИФ в промышленности, медицине иммуноферментный анализ.

Графологическая структура модуля «Белки. Ферменты» (см. приложение 2).