Самостоятельная работа студентов

Работа № 1. Высаливание белков сыворотки крови сернокислым аммонием.

Реакция высаливания обусловлена дегидратацией макромолекул белка с одновременной нейтрализацией электрического заряда. Высаливание белков сернокислым аммонием может быть использовано для разделения белков друг от друга и получения их в кристаллическом виде. Например, глобулины сыворотки крови, имеющие большой молекулярный вес и меньший заряд  легче высаливаются, чем альбумины. Глобулины осаждаются в полунасыщенном, а альбумины - в насыщенном растворе сернокислого аммония.

Высаливание белков – обратимый процесс. Осадок белка может вновь раствориться в воде после уменьшения концентрации солей. При этом белок не теряет своих естественных биологических свойств.

Ход работы.В пробирку поместить 2 мл сыворотки крови и добавить равный объем насыщенного раствора сернокислого аммония, перемешать. Получается полунасыщенный раствор сернокислого аммония, в котором выпадает осадок глобулина.

Осадок отфильтровать через бумажный фильтр в пробирку. К фильтрату добавить сухой сернокислый аммоний до полного насыщения раствора. Выпавший осадок альбумина отфильтровать через бумажный фильтр. Проверить фильтрат на отсутствие белка с помощью биуретовой реакции.

Для доказательства обратимости высаливания, полученные осадки прямо на фильтрах смочить с 2-3 мл дистиллированной воды и отметить их растворение.

Сделать вывод.

Работа № 2. Осаждение белков при кипячении.

При нагревании почти все белки денатурируют и выпадают в осадок. При этом разрушаются водородные связи, происходит изменение вторичной и третичной структуры белка, белок теряет глобулярную форму и на поверхность молекулы, вместо гидрофильных групп, выходят гидрофобные. В сильнокислых и щелочных средах растворы белков при кипячении не коагулируют и могут дать осадок лишь при добавлении какой-нибудь нейтральной соли (NaCl). В этих случаях устойчивость белка в растворе зависит от приобретения положительного заряда в сильно-кислой среде и отрицательного заряда в щелочной. Наиболее легко белки подвергаются тепловой денатурации в изоэлектрической среде.

Клинико-диагностическое значение.Осаждение белков кипячением используется для качественного обнаружения белка в моче.

Ход работы.В 5 пробирок налить по 0,5 мл сыворотки. В 3-ю пробирку добавить 10 капель 1% раствора уксусной кислоты, для создания кислой среды. В 4-ю пробирку 10 капель 1% раствора уксусной кислоты и 5 капель насыщенного раствора поваренной соли. В 5-ю пробирку добавить 5 капель 10% раствора щелочи.

Все пробирки прокипятить. После кипячения во 2-ю пробирку добавить 1-2 капли 1% раствора уксусной кислоты.

Записать в таблицу результаты осаждения белка при кипячении. Отметить появление осадка плюсом, а отсутствие минусом и указать в каждом случае причины появления или отсутствия осадка белка.

Работа № 3. Осаждение белков солями тяжелых металлов.

Осаждение белков солями тяжелых металлов происходит при небольших концентрациях этих солей. Белки при взаимодействии с солями тяжелых металлов (свинца, меди, серебра, ртути и др.) адсорбируют их, образуя с ними солеобразные и комплексные соединения, растворимые в избытке солей. Клиническое значение: способность белка прочно связывать ионы тяжелого металла, в виде нерастворимых осадков в воде, позволяет использовать их как противоядие при отравлении солями ртути, меди, свинца и другими тяжелыми металлами.

А) Осаждение белков медным купоросом.

Налить в пробирку 1 мл раствора белка и по каплям добавить 10% раствор CuSO₄ до образования осадка, нерастворимого в воде. При добавлении 10% раствора CuSO₄ в большом объеме наблюдают растворение осадка в избытке реактива. Растворение осадка в избытке солей называется адсорбционной пептизацией. Данное явление происходит вследствие возникновения одноименного положительного заряда на частицах белка.

Б) Осаждение белков уксуснокислым свинцом.

К 1,0 мл раствора белка добавить 2-5 капель 5% раствора уксуснокислого свинца до образования осадка.

По выполненной работе сделать вывод.

Работа № 4. Осаждение белков органическими кислотами.

Некоторые органические кислоты вызывают необратимые осаждение белков. Клинико-диагностическое значение: сульфосалициловая кислота используются для обнаружения малых количеств белка в биологических жидкостях (спино-мозговой жидкости, моче, экссудатах). Трихлоруксусная кислота используется для получения безбелкового фильтрата крови в лабораторной практике.

Ход работы.К 0,5-1,0 мл раствора белка добавить равный объем 10% раствора сульфасалициловой кислоты или 5% раствора трихлоруксусной кислоты. Отметить выпадение белого осадка.

Сульфосалициловая кислота

Работа № 5. Осаждение белков концентрированной азотной кислотой (проба Геллера).

Выпадение белка в осадок при действии некоторых минеральных кислот связано с дегидратацией белковых частиц и образованием комплексных солей белка с кислотами. Клинико-диагностическое значение: в избытке всех минеральных кислот, за исключением азотной, выпавший осадок белка растворяется. Поэтому реакция осаждения белков азотной кислотой используется для качественного, а также для количественного (см. ниже) анализа мочи (проба Геллера).

Ход работы. К 1 мл концентрированной азотной кислоты осторожно по стенке пробирки, наклонив ее под углом 45⁰ так, чтобы обе жидкости сразу не смешивались, наслоить равный объем раствора белка.

На границе двух жидкостей образуется осадок в виде белого кольца.

По работе сделать вывод.

Работа № 6. Количественное определение белка в моче по методу