Постановка оксидазного теста

Методические указания

1.Разбор понятия «санитарно-показательные микроорганизмы (СПМО)», знакомство с основными требованиями для СПМО

Санитарно-показательными называют микроорганизмы, являющиеся постоянными обитателями естественных полостей тела человека и животных, которые способны постоянно выде­ляться во внешнюю среду.

Санитарно-показательные микроорганизмы должны соответствовать следующим требованиям.

1. Постоянное обитание в естественных полостях человека и живот­ных и постоянное выделение во внешнюю среду.

2. Отсутствие размножения во внешней среде.

3. Длительность выживания и устойчивость во внешней среде не меньше или даже выше, чем у патогенных микроорганизмов.

4. Отсутствие «двойников», с которыми СПМО можно перепутать.

5. Относительно низкая изменчивость во внешней среде.

6.   Наличие простых в исполнении и надёжных методов индикации.

2.Разбор прямых и косвенных методов, применяемых для

 санитарной оценки объектов внешней среды

Для определения санитарно-эпидемиологического состояния внешней среды в санитарной микробиологии применяется два метода – прямое обнаружение микроорганизмов и косвенная индикация возможного их присутствия.

Прямой методявляется более надёжным, но и вместе с тем трудоёмким и недостаточно чувствительным. Трудности выделения патогенных микроорганизмов из внешней среды обусловлены их незначительной концентрацией, неравномерностью распределения, конкуренцией между патогенны­ми микроорганизмами и сапрофитной микрофлорой. Огромное зна­чение имеет изменчивость возбудителя во внешней среде. Необходимо вести исследования в широком диапазоне, в том числе и по обнару­жению условно-патогенных микроорганизмов, так как выделение одного вида возбудителя не свидетельствует об отсутствии других. Поэтому прямое выделение патогенных микроорганизмов проводят только по эпидемиологическим показаниям.

Косвенный методиндикацииво внешней среде более прост и доступен. Данный метод располагает двумя показателями-критериями, которые позволяют определить санитарно-эпидемиологическую ситуацию. К ним относят общее микробное число и концентрацию СПМО.

3. Общее микробное число и методы его определения

Общее микробное число(ОМЧ) – число всех микроорганизмов в 1 мл или в 1 г субстрата.

При этом учитывают, что чем боль­ше микроорганизмов обнаружено во внешней среде, тем вероятнее загрязнение патогенными микроорганизмами. В связи с этим ОМЧ даёт представление об эпидемиологической обстановке.

Существуют три метода определения ОМЧ.

1. Оптический метод прямого подсчёта бактерий под микроскопом в камере Горяева.

2. Бактериологический метод (менее точный).

3. Измерение биомассы.

Оптический методобычно используют на водопроводных станциях при оценке эффективности работы очистных сооружений, но он не позволяет отличить живые бактерии от мёртвых. Исследование можно выполнить в течение 1 ч, поэтому метод незаменим в аварийных ситуациях. Метод позволяет судить о состоянии процессов самоочищения воды. В начальной стадии процесса самоочищения грамотрицательных бактерий больше, чем грамположительных, а палочковидных форм больше, чем кокковых. На завершающей стадии соотношение меняется на обратное.

Бактериологическим методомвыявляют определённую физиологи­ческую группу бактерий, растущих при данных условиях. Например, обнаружение вегетативных форм микроорганизмов в прошедшем термическую обработку пищевом продукте свидетельствует о пов­торном заражении продукта после термической обработки или же о неэффективности последней. Обнаружение спор подтверждает удов­летворительное качество термической обработки.

Измерение биомассыосуществимо только в специализированных лабораториях путём взвешивания остатков бактериальной массы, определения показателей клеточного обмена и др. В практике этот метод не применяют.

ОМЧ определяют в следующих случаях:

· контроль качества очистки воды (в том числе колодезной);

· проверка эффективности мойки посуды;

· контроль чистоты воздуха в закрытых помещениях;

· определение свежести скоропортящихся продуктов;

· выбор места для строительства жилых объектов (исследование почвы);

· определение характера микрофлоры

4. Знакомство с основными группами санитарно-показательных микроорганизмов, разбор свойств и методов их выделения. Микроскопия готовых препаратов.

СПМО подразделяются на три группы.

4.1. Первая группа СПМО

Индикаторы фекального загрязнения – представители микрофлоры кишечника человека и животных:

· бактерии группы кишечных палочек (БГКП);

· энтерококки;

· протей;

· сульфитредуцирующие клостридии;

· термофилы, кишечные бактериофаги, сальмонеллы;

· бактероиды, бифидо- и лактобактерии;

· синегнойная палочка;

· грибы рода Candida;

· ацинетобактер.

Группа кишечных палочек представлена микроорганизмами родов Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Serratia, Klebsiella, экологические особенности которых определяют их индикаторную значимость.

Escherichia. Показатель свежего фекального загрязнения, возможная причина пищевых токсикоинфекций. Для идентификации используют биохими­ческие тесты, учитывая способность к ферментации лактозы при температуре 44±0,5 °С и отсутствие роста на цитратсодержащих сре­дах.

Представителей рода, находящихся в воде, трактуют как термото­лерантные колиформные бактерии, в лечебных грязях – как фекаль­ные колиформные бактерии, в пищевых продуктах - как Е. coli.

Необходимо отметить, что кишечная палочка не является идеальным СПМО.

Недостатки кишечной палочки в качестве СПМО:

1. Обилие аналогов во внешней среде.

2. Изменчивость во внешней среде.

3. Недостаточная устойчивость к неблагоприятным воздействия.

4. Недостаточно длительное выживание в продуктах по сравнению с шигеллами Зонне, сальмонеллами, энтеровирусами.

5. Способность к размножению в воде.

6. Нечёткий индикатор даже в отношении присутствия сальмонелл.

Citrobacter. Этиологическая роль бактерий рода Citrobacter дока­зана при эпидемических вспышках, клинически протекающих с явле­ниями диспепсии, гастроэнтероколита, пищевой токсикоинфекций.

Пищевые токсикоинфекций, обусловленные этими микроорганиз­мами, возникают при употреблении в пищу продуктов, в которых возбудители размножались в течение какого-то времени и накопились в достаточно большом количестве. Источниками инфекции обычно слу­жат больные или бактерионосители. Заболевание чаще возникает после употребления заражённых пищевых продуктов (мясных, молочных).

Enterococcus.На роль СПМО были  предложены в 1910 г. (Enterococcus faecalis и Enterococcus faecium).

Преимущества энтерококка как СПМО.

1. Постоянно находится в кишечнике человека и постоянно выделяется во внешнюю среду.

При этом Е. faecalis в основном обитает кишечнике человека, поэтому обнаружение его свидетельствует загрязнении фекалиями людей. В меньшей степени у человека встречается E. faecium. Последний в основном обнаруживается в кишечнике животных, хотя сравнительно редко также отмечается и Е. faecalis.

2. Не способен размножаться во внешней среде, в основном размножается E. faecium, но он имеет меньшее эпидемиологическое значение.

3. Не изменяет своих свойств во внешней среде.

4. Не имеет аналогов во внешней среде.

5. Устойчив к неблагоприятным воздействиям внешней среды.

Энтерококк в 4 раза устойчивее к хлору по сравнению с кишечной палочкой. Это главное его достоинство. Благодаря этому признак энтерококк используют при проверке качества хлорирования воды, а также как индикатор качества дезинфекции. Выдерживает температуру 60 °С, что позволяет применять его как показатель качеств пастеризации. Устойчив к концентрациям поваренной соли 6,5-17%. поэтому может быть использован в качестве индикатора при исследовании солёных продуктов, морской воды, в которых кишечная палочка гибнет или становится атипичной. Устойчив к рН в диапазоне 3-12, что делает его индикатором фекального загрязнения при исследовании кислых продуктов.

6. Для индикации энтерококков разработаны высокоселективные среды.

При обнаружении в воде атипичных кишечных палочек присутствие энтерококков становится главным показателем свежего фекального загрязнения.

В открытых водоёмах определяют соотношение ФКП/ФЭ, где ФКП - фекальная кишечная палочка, а ФЭ - фекальные энтерококки. При значении ФКП/ФЭ ≥ 10 подозревают сброс в водоём нехлорированных сточных вод. Если показатель находится в пределах 0,1-1, хлорирование сточных вод достаточное, так как ФЭ в 4 раза устойчивее к хлору, чем кишечная палочка.

Бактерии рода Proteus встречаются в 98% случаев в выделениях кишечника человека и животных, из них в 82% случаев – P. mirabilis. Обнаружение протея в воде и продуктах указывает на загрязнение объектов разлагающимися субстратами и свидетельствует о крайнем санитарном неблагополучии. При обнаружении протея в пищевых продуктах их бракуют, а воду не разрешают употреблять для питья.

Clostridium perfringensв качестве СПМО также имеет достоинства и недостатки:

· непостоянно обнаруживается в кишечнике человека;

· длительно сохраняется во внешней среде за счёт спорообразования, поэтому не свидетельствует о свежем фекальном загрязнении;

· на эти бактерии губительно действует сопутствующая микрофлора;

· споры устойчивы к концентрациям активного хлора 1,2-1,7 мг/л воды;

· С. perfringens может служить косвенным показателем наличия в воде энтеровирусов.

Определение С. perfringens проводят в воде открытых водоёмов, почве, лечебных грязях, мясных продуктах.

Термофилы. Это целая группа СПМО, в основном споровых, растущих при температуре 55-60 °С. Обитают во внешней среде и служат показателем загрязнения навозом и компостом. При гниении навоза или компоста температура поднимается более 60 °С, и термофилы бурно размножаются. О степени загрязнения судят по количеству термофилов. В России их определяют при исследовании почвы, а также в консервах как индикатор термической обработки, особенно при хранении в условиях жаркого климата.

Бактериофаги. В качестве СПМО используют бактериофаги кишечной палочки – коли-фаги, фаги сальмонелл и шигелл. Их обнаруживают там, где есть соответствующие бактерии, к которым эти фаги адаптированы. Фаги выживают во внешней среде более 9 мес. Они ценны как показатель фекального загрязнения, особенно энтеровирусами, так как фаги выделяются из сточных вод с той же частотой, что и энтеровирусы. По устойчивости к хлору фаги сравнимы с энтеровирусами.

Необходимо помнить:

1. О массивности свежего фекального загрязнения судят по количеству БГКП и энтерококков.

2. О давности фекального загрязнения судят по соотношению БГКП, энтерококков и клостридий.

3. О характере загрязнения судят по соотношению фекальных бактерий и термофилов.

Salmonella.В 30-х г. XX века У. Вильсон и Э. Блер предложили сальмонелл в качестве СПМО.

Преимущества сальмонелл как СПМО.

1. Сальмонеллы – наиболее распространенные микроорганизмы, вызывающие острые кишечные заболевания (ОКЗ), могут служить индикатором других ОКЗ с аналогичными патогенезом и эпидемиологией. Количество носителей сальмонелл среди людей и животных значительное. Их довольно часто обнаруживают даже в сточных водах.

2. Поступают во внешнюю среду только с фекалиями человека и животных.

3. Размножаются в почве при наличии в ней большого количества органических веществ, однако могут размножаться даже в чистой воде.

При определении сальмонелл в воде следует вычислять не только процент положительных обнаружений, но и НВЧ. По этому показателю можно оценить эпидемиологическую ситуацию.

Бактероиды. Вопрос о бактероидах окончательно ещё не решён. Бактероиды обнаруживают в 1 г фекалий в концентрациях 10⁷-10¹¹. Это грамотрицательные палочки, строгие анаэробы, подвижные и неподвижные, образуют мелкие колонии, требовательны к питательным средам. Они – постоянные обитатели кишечника человека, их количество значительно превышает все другие СПМО.

 Преимущества бактероидов как СПМО.

1. Бактероидов много, они в больших количествах выделяются во внешнюю среду.

2. Не имеют двойников.

3. Не размножаются во внешней среде.

4. Отмирают во внешней среде быстрее, чем кишечные палочки, поэтому служат показателями свежего фекального загрязнения.

Однако имеются определённые трудности с их выращиванием, так как необходимы специальные питательные среды и особые условия культивирования.

Синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa). Недостатки синегнойной палочки как СПМО.

1. Обнаруживается в фекалиях здоровых людей в 11%, а у животных в 7% (т.е. непостоянно).

2. Способна размножаться во внешней среде.

3. Методы индикации просты, но только в отношении пигментных форм, а во внешней среде преобладают беспигментные формы, которые распознать трудно.

4. Обнаруживается в 90% случаев в сточных водах, больничных палатах. Наличие синегнойной палочки свидетельствует о неблагополучном санитарном состоянии лечебного учреждения.

Роль её выросла в связи с распространением антибиотикорезистентных штаммов и появлением большого количества носителей.

Грибы рода Candida. В последнее время предпринимаются попытки использовать эти грибковые микроорганизмы как санитарно-показательные, так как они постоянно присутствуют в организме человека: в фекалиях в 10-90% случаев, в слизи верхних дыхательных путей – в 15-50%, на коже – в 1-100%. Они обнаруживаются везде, где есть сахаросодержащие вещества. Первоисточником в природе служат человек и животные. Грибы кандида очень устойчивы к неблагоприятным воздействиям внешней среды, даже более, чем патогенные бактерии. Их можно использовать в качестве индикаторов эффективности дезинфекции.

4.2. Вторая группа СПМО.

Индикаторы воздушно-капельного загрязнения - ком­менсалы верхних дыхательных путей:

· стрептококки;

· стафилококки.

Представителей этой группы СПМО определяют в воздухе, молочных продуктах, воде. К ним относится зеленящий стрептококк (S. salivarius). У него есть двойники, так как S. lactis, S. bovis, S. equinus, S. cremoris. Но эти двойники редко обнаруживаются в жилых помещениях. Зеленящими могут быть и энтерококки, но они сами являются СПМО.

Другой санитарно-показательный стрептококк – β-гемолитический стрептококк. Его обнаруживают в 80% у людей, страдающих в основное воспалительными заболеваниями верхних дыхательных путей. Он обладает гемолитическими свойствами.

Показателем санитарного неблагополучия считается и золотистый стафилококк. Именно этот вид стафилококка связан с присутствием людей и некоторых животных. В среднем у здоровых людей золотистый стафилококк обнаруживают в 30% случаев, а у медицинского персонала до 96%. Этот вид стафилококка отличается длительностью выживания и устойчивостью во внешней среде. Он может быть косвенным индикатором загрязнения воздуха вирусами. Использование золотистого стафилококка, как наиболее информативного СПМО, рекомендовано при исследовании воздуха жилых помещений, жилых отсеков космических кораблей, подводных лодок, лечебно-профилактических учреждений.

На роль СПМО выдвигаются также антибиотикорезистентные стафилококки и микрококки, 5-6-кратное превышение указанных СПМО в воздухе больничных помещений по сравнению с воздухом внебольничных помещений следует оценивать как плохой прогностический признак.

4.3. Третья группа СПМО

Индикаторы процессов самоочищения – обитатели вне­шней среды:

· протеолиты;

· аммонификаторы и нитрификаторы;

· аэромоносы и бделловибрионы;

· споровые микроорганизмы;

· грибы и актиномицеты;

· целлюлозобактерии.

Бделловибрионы предложены в качестве СПМО в 1962 г. Это аэробные грамотрицательные палочки, размером 0,25-1,2 мкм, подвижные, имеют жгутики, по отношению к другим бактериям – хищники, поражающие толь­ко грамотрицательные палочки. На одном из полюсов бделловибрионов есть полость, где скапливаются экзотоксин и липолитический фермент, который растворяет клеточную стенку бактерий. Отличают их друг от друга по литической активности: одни лизируют только псевдомонады, а другие только аэромонады. Бделловибрионы применяют для биологической очистки воды (искусственно выпускают в воду плавательных бассейнов), используют и как СПМО по загрязнению воды. В местах сброса сточных вод количество бде­лловибрионов достигает 3000 КОЕ/см³, в отдалении от сброса - 10 КОЕ/см³. Выделяют бделловибрионы по методу Грация, но для постановки пробы необходим индикаторный штамм Е. coli К-12. Количество их выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ/см³).

Аэромонады. В 1969 г. предложено использовать в качестве СПМО аэромонады. Они в больших количествах содержатся в сточных водах и обладают большой энергией размножения. Служат показателем нагрузки сточных вод на водоём и имеют такое же значение, как ОМЧ. При большой концентрации аэромонад в воде может наступить пище­вое отравление.

Контрольные вопросы

Что служит объектами изучения санитарной микробиологии?

Какие микроорганизмы называют санитарно-показательными?

Назовите основные требования, которым должны отвечать СПМО?

В чем сущность прямого метода санитарной оценки объектов внешней среды?

Какие существуют показатели-критерии косвенного метода индикации микроорганизмов внешней среды?

Что такое ОМЧ?

Какие методы определения ОМЧ вы знаете?

Какие микроорганизмы относятся к первой группе СПМО?

Какие бактерии называют колиформными?

Какими ферментативными свойствами обладают ОКБ?

Почему кишечная палочка не является идеальным СПМО?

Какие преимущества энтерококков в качестве СПМО вы знаете?

Какие колонии образуют на среде Эндо типичные лактозоположительные бактерии?

Какие микроорганизмы относятся ко второй группе СПМО?

Какие заболевания вызывают стафилококки?

Какие микробиологические методы используют для диагностики заболеваний, вызываемых гноеродными кокками?

Как производят бактериологическое исследование при различных стрептококковых заболеваниях?

Какие микроорганизмы являются индикаторами самоочищения внешней среды?

Что такое титр СПМО?

Что такое индекс СПМО?

Что такое наиболее вероятное число?

ПРИЛОЖЕНИЕ К ЗАНЯТИЮ №1.

Объектами санитарно-микробиологического исследования служат вода, воздух, почва, объекты окружающей среды, а также пищевые продукты, оборудование пищеблоков, больничная среда, фармацевтические объекты.

Биологические загрязнения:

•  загрязнения патогенными и условно-патогенными микроорганизмами, цианобактериями, микроорганизмами, предназначенными для борьбы с насекомыми, микроорганизмами-продуцентами токсических веществ;

• загрязнения различными веществами - антибиотиками, белками, ферментами, витаминами.

По размеру наносимого ущерба к наиболее значимым биологическим загрязнителям относят:

· хозяйственно-бытовые и сточные воды;

· отходы животноводческих комплексов;

· отходы промышленных предприятий по производству антибио­тиков, вакцин, сывороток, белков, витаминов, ферментов и т.п.;

· сине-зеленые водоросли, массово развивающиеся в открытых водоёмах.

Для каждого вида загрязнения должны быть определены предель­ные допустимые концентрации (ПДК), которые:

·  не влияют отрицательно на процессы самоочищения внешней среды;

·  не подавляют развитие санитарно-показательных микроорганиз­мов (СПМО) и не усиливают их патогенных свойств;

·  не удлиняют сроков выживания микроорганизмов

·  не способствуют ухудшению здоровья людей.

Чем выше концентрация СПМО, тем больше вероятность при­сутствия патогенных микроорганизмов. Их количество выражают в титрах и индексах.

Тump – минимальное количество субстрата (в кубических сантиметрах или граммах), в котором ещё обнаруживают СПМО.

Индекс – количество СПМО, которое содержится в 1 л воды или в 1см³ другого субстрата.

Наиболее вероятное число (НВЧ)– количество СПМО в 1 л воды или в 1 г (см³) другого субстрата. Это более точный показатель, так как он имеет доверительные границы, в пределах которых может колебаться
с вероятностью 95%.

З А Н Я Т И Е 2

Дата ______________

Тема: Санитарно-микробиологическое исследование воды централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения.

План занятия

1. Знакомство с правилами отбора, хранения и транспортировки проб воды.

2. Санитарно-бактериологическое исследование воды питьевой:

а) определение ОМЧ (разбор схемы).

б) титрационный метод (разбор схемы);

в) метод мембранной фильтрации (разбор схемы).

3. Определение спор сульфитредуцирующих клостридий методом прямого посева.

4. Определение коли-фагов.

Методические указания

1. Знакомство с правилами отбора, хранения и

транспортировки проб воды

Демонстрация посуды и емкостей, разбор правил отбора, хранения и транспортирования проб воды для микробиологического исследования.

2. Определение общего числа микроорганизмов (ОМЧ)

Разбор нормируемых микробиологических показателей качества воды: общее микробное число (ОМЧ), общие колиформные бактерии (ОКБ), термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ), коли-фаги.

а) Определение ОМЧ (разбор схемы)

Для определения ОМЧ воды чаще всего используют метод 10-кратных разведений, когда концентрация микроорганизмов каж­дого последующего разведения в 10 раз меньше предыдущего, затем разведения высевают на питательные среды. В пустые стерильные чашки Петри, соблюдая правила асептики, стерильной пипеткой вносят 1 см³ из заранее приготовленного разведения. Чашки предварительно маркируют (со стороны донышка, а не крышки!), чтобы исключить случайную замену их при падении, сдвиге и др.

Разведения выбирают с таким расчётом, чтобы на чашке выросло от 30 до 300 колоний. Из каждой пробы засевают два разведения. Не позднее чем через 15 мин после внесения материала (разведения) в чашку наливают расплавленного и остуженного до 45⁺5 °С 10-12 см³ питательного агара (питательную среду), толщина слоя которого должна быть 4-5 мм. Расплавленную среду и посевной материал незамед­лительно тщательно перемешивают круговыми движениями, чтобы микроорганизмы равномерно распределились в массе среды. Чашки Петри оставляют на холодной горизонтальной поверхности на 10-15 мин для охлаждения и застывания среды, после чего посевы помещают в термостат и инкубируют при заданной температуре и экспозиции.

Для дальнейшей работы выбирают чашки, на которых выросло от 30 до 300 колоний, а при посеве нативного материала - от 1 до 300 колоний. Количество колоний на поверхности и в глубине агара подсчитывают визуально или при помощи лупы с 2-5-кратным увеличением.

б) Определение ОКБ и ТКБ титрационным методом

Метод основан на накоплении бактерий после посева определенных объемов воды в жидкие питательные среды, с последующим пересевом на дифференциальную плотную среду с лактозой и идентификации колоний по культуральным и биохимическим тестам. При исследовании питьевой воды качественным методом (текущий санэпиднадзор) засевают три объема по 100 см³. При исследовании воды с целью количественного определения ОКБ и ТКБ (повторный анализ) засевают соответственно 100, 10 и 1 см³ - по три объема каждой серии.

Посевы 10 и 100 см³ воды проводят соответственно в 1 и 10 см³ среды накопления - концентрированной ЛПС без индикатора. Посев 1 см³ пробы проводят в 10 см³ ЛПС обычной концентрации. Посевы инкубируют при температуре 37 °С в течение 48 ч. Через 24 ч проводят предварительную оценку посевов в среде накопления. Из ёмкостей, где отмечено наличие роста (помутнение) и образование газа, материал высевают бактериологи­ческой петлёй на сектора среды Эндо для получения изолированных коло­ний. Ёмкости без видимых признаков роста и образования газа оставляют в термостате до 48 ч и ещё раз просматривают для окончательной оценки.

Результаты посевов без признаков роста считают отрицательными, и дальнейшему изучению они не подлежат. Из ёмкостей, где отмечены помут­нение и образование газа (или только помутнение), делают высев на сектора среды Эндо. Посевы на среде Эндо инкубируют при температуре 37 °С 18-20 ч. При появлении помутнения, образовании газа в среде накопления и росте на среде Эндо колоний, типичных для лактозоположительных бак­терий (тёмно-красных или красных, с металлическим блеском или без него, выпуклых с красным центром и отпечатком на питательной среде), дают положительное заключение о присутствии ОКБ в данном объёме пробы.

Наличие ОКБ необходимо подтвердить в следующих случаях:

· в среде накопления отмечено только помутнение;

· принадлежность к лактозоположительным колониям вызывает сомнение.

Для подтверждения присутствия ОКБ выполняют следующие действия:

· проверяют наличие отпечатка на среде Эндо после снятия петлёй подозрительной колонии;

· выполняют оксидазный тест;

· проверяют принадлежность к группе по Граму;

· подтверждают способность к газообразованию при посеве 1-2 изоли­рованных колоний всех типов с каждого сектора в среду подтвержде­ния (ЛПС с индикатором) с последующей инкубацией посевов при температуре 37 °С в течение 24-48 ч.

При отсутствии изолированных колоний проводят рассев на среду Эндо общепринятыми бактериологическими методами. Отрицательное заключение дают, если:

· в среде накопления нет признаков роста;

· на секторах среды Эндо нет роста;

· на секторах среды Эндо выросли нехарактерные для колиформных бактерий колонии (прозрачные, с неровными краями, расплывчатые);

· все колонии оказались оксидазоположительными;

· все колонии оказались грамположительными;

· в подтверждающем тесте на среде ЛПС с индикатором не отме­чено газообразования.

Для определения ТКБ работают с секторами среды Эндо, где выросли типичные лактозоположительные колонии. Делают посев двух-трёх изолированных колоний каждого типа из каждого сектора в пробирки с любой из лактозных сред накопления, инкубируют при температуре +44 °С течение 24 ч. При образовании газа в лактозной среде накопления, росте на среде Эндо лактозоположительных бактерий и выявлении способности к ферментации лактозы до кислоты и газа в подтверждающих лактозных средах при температуре 44 °С в течение 24 ч дают положитель­ное заключение о наличии в этом объёме воды ТКБ. Во всех остальных случаях дают отрицательное заключение.

в) Определение ОКБ и ТКБ методом мембранных фильтров

Метод основан на фильтровании определенных объемов воды через мембранные фильтры. Для этих целей используют фильтры с диаметром пор 0,45 мкм и размером 35 или 47 мм в диаметре (отечественные фильтры «Владипор» МФАС–С–1, МФАС–С–2, МФАС–МА (№ 4-6) или зарубежные – ISO 9000 или EN 29000). При исследовании воды неизвестного качества для получения изолированных колоний фильтруют следующие объёмы воды: 10, 40, 100 и 150 см³ соответственно на 4 фильтра. Далее фильтры помещают на чашки со средой Эндо и инкубируют при 37°С или 44°С в течение 24 ч. Если на фильтрах нет роста колоний или отмечен рост плёнчатых, губчатых, плесневых, прозрачных или расплывчатых колоний, то выдаётся отрицательный ответ.

При наличии подозрительных колоний (S-  или R- тип, лактозоположительные) ставят тест на оксидазу, окрашивают по Граму, проводят посев на жидкую лактозо-пептонную среду (ЛПС).

Постановка оксидазного теста

Полоску фильтровальной бумаги помещают в чистую чашку Петри и наносят 2-3 капли реактива для оксидазного теста (1% спиртовой раствор α-нафтола и 1% водный раствор фенилендиаминового соединения, перед постановкой теста к 3 частям α-нафтола добавляют 7 частей фенилендиа­минового соединения). Возможно использование тест-систем СИБ-оксидаза. Реактивы и тест-системы периодически проверяют на тест-культурах: P. aeruginosa - оксидазоположительной и E.coli - оксидазоотрицательной. Часть изолированной колонии изучаемой культуры стеклянной палоч­кой наносят на пропитанную реактивом фильтровальную бумагу. Если в течение 1 мин появляется фиолетово-коричневое окрашивание, культура считается оксидазоположительной и дальнейшему изучению не подлежит. Если реакция на оксидазу отрицательная (цвет на месте нанесения куль­туры не меняется), культура подлежит дальнейшему исследованию. Из оксидазоотрицательной колонии делают мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют. Грамотрицательные бактерии окрашива­ются в красный или розовый цвет.