Оценка индукции синтеза ДНК клетками млекопитающих

Принцип метода заключается в оценке интенсивности репаративных процессов, инициируемых химическим повреждением ДНК. В основе метода лежит авторадиографическое определение степени инкорпорации меченного тритием тимидина в ядра клеток, предварительно обработанных обследуемым веществом.

Исследования обычно выполняются на гепатоцитах взрослых крыс самцов, диспергированных в инкубационной среде с последующей спонтанной адгезией на стеклянные подложки. В качестве положительного контроля используют гепатоциты, обработанные веществами, вызывающими повреждение ДНК и стимулирующими процесс её репарации: афлатоксином В₁ или 2-ацетиламинофлюореном; отрицательные контроли - гепатоциты не подвергавшиеся воздействию. Перед исследованием клетки на определенное время помещают в среду, содержащую обследуемый токсикант. Выбор концентрации вещества осуществляется в ходе предварительных опытов, путем определения кривой зависимости "доза-эффект" по показателю жизнеспособность клеток (окраска обработанных веществом клеток трипановым синим). После воздействия клетки отмывают и помещают в среду, содержащую тимидин, меченый тритием. После инкубации их высушивают, фиксируют и покрывают эмульсией для авторадиографического исследования. Спустя определенный экспозиционный период (обычно несколько недель) производят подсчет числа оптически плотных гранул над областью ядра клеток, отражающих степень инкорпорации тимидина. Поскольку гепатоциты обладают высокой способностью к репарации, чем выше степень инкорпорации тимидина, тем большее повреждение ДНК вызвал исследуемый агент.

Недостатком метода является то, что с его помощью невозможно оценить, приводит ли процесс репарации к формированию ошибок генетического кода (формируются ли мутации), то есть решить, является ли инициированное повреждение ДНК пагубным для клетки.

Исследование ковалентного связывания токсикантов

Поскольку многие мутагены способны образовывать ковалентные связи с пуриновыми и пиримидиновыми основаниями молекул ДНК (аддукты ДНК), выявление аддуктов ДНК является прямым свидетельством генотоксичности ксенобиотика. Неинвазивные методы предполагают выявление аддуктов в моче животных, подвергшихсявоздействию токсикантов; инвазивные - выделение органов и тканей отравленных животных, экстракцию из гомогенатов тканей ДНК и нуклеотидов, с последующим их химическим (иммунохимическим) анализом.

Изучение хромосомных аберраций

Хромосомные аберрации, вызванные действием химических веществ, могут быть выявлены путем окрашивания клеток и последующего изучения с помощью обычного светового микроскопа. Для исследования могут использоваться культуры клеток (например, яичника китайского хомячка), обработанные изучаемым токсикантом по одной из схем, описанных выше, клетки костного мозга или лимфоциты периферической крови млекопитающих, которым токсикант вводилиin vivo. Виды выявляемых мутаций при этом включают: выпадение хроматидов, разрывы хромосом, делеции хромосом, появление хромосомных фрагментов, транслокации, полиплоидии.

Одним из широко используемых методов выявления генотоксичности является так называемый "микронуклеарный тест". Микроядра представляют собой фрагменты хромосом или целые хромосомы, не включенные в состав ядра, в ходе митотического деления клетки. Как правило, образование микроядер провоцируется веществами, вызывающими разрывы хромосом (кластогенные агенты) и токсикантами, повреждающими белки митотического веретена (см. выше). Токсиканты обычно вводят в дозах, составляющих 0,1 или 0,5 ЛД₅₀. Контролем служит растворитель. У животных (как правило, мышей), подвергшихся действию химического вещества, после умерщвления, осуществляют забор косного мозга, окрашивают препарат и подвергают его микроскопии. Забор материала производят в течение определенного времени с интервалом 2 суток после прекращения (или на фоне продолжающегося) введения токсиканта. Количество клеток, содержащих микроядра, в препаратах костного мозга, полученных от животных разных групп, подсчитывают и сравнивают.

Повреждение герменативного эпителия (нарушения сперматогенеза) токсикантом может быть выявлено в опытах на крысах, мышах, хомячках. Самцам лабораторных животных изучаемый токсикант вводят в течение времени, необходимого для реализации полного цикла сперматогенеза, периодически (раз в неделю), спаривая их с самками разных групп. Самки умерщвляются спустя 2 недели после спаривания. Исследуются: состояние желтых тел яичников, соотношение живых и погибших эмбрионов. Конечными характеристиками оценки мутагенеза являются: индекс оплодотворяемости (отношение оплодотворенных самок к общему числу, спарившихся с самцами), преимплантационные потери (соотношение числа имплантировавшихся эмбрионов к числу желтых тел в яичниках),количество животных с мертвыми имплантатами относительно общего числа беременных самок, количество погибших имплантатов к общему количеству имплантатов.

Наследуемые мутации могут быть выявлены путем прямого исследования клеток потомства (на различных стадиях развития) самок или самцов, подвергшихся воздействию токсикантов.

Описание других, более сложных методов исследования, можно найти в специальной литературе.

ГЛАВА 6.3. ХИМИЧЕСКИЙ КАНЦЕРОГЕНЕЗ