Условия действия мутагенов на клетки

Все клетки организма находятся в одной из фаз клеточного цикла:

1. Покоя (фаза G₀): клетка функционирует или покоится (большинство соматических неделящихся клеток);

2. Синтеза клеточных компонентов, необходимых для последующего синтеза ДНК (фаза G₁): идет накопление необходимого количества пуриновых и пиримидиновых оснований и других химических компонентов ДНК. В делящейся клетке процесс занимает до 40% общего времени цикла клеточного деления;

3. Синтеза ДНК (фазаS): осуществляется "сборка" новой молекулы ДНК из наличествующих в клетке компонентов. Процесс занимает до 39% времени клеточного цикла.

4. Синтеза клеточных компонентов для митоза (фазаG₂). В частности синтезируется мономеры и полимер тубулина и т.д. Процесс занимает около 19% времени цикла делящейся клетки.

5. Митоза (фазаM): разделение генетического материала между вновь образующимися дочерними клетками; клеточное деление. Процесс занимает 2% времени.

Часть химические вещества способны вызывать мутации лишь тех клеток, которые находятся в определенной фазе цикла, это так называемые цикло-специфичные вещества. Другие действуют на генетический аппарат не зависимо от того, в каком периоде клеточного цикла находится клетка (цикло-неспецифичные). Такая особенность в действии веществ определяется механизмом, посредством которого токсикант повреждает ДНК (см. выше). К числу цикло-неспецифичных принадлежат мутагены, способные вызывать химическое повреждение нуклеотидов (алкилирующие агенты и химические модификаторы нуклеотидов). Все остальные мутагены являются цикло-специфичными.

Изучение мутагенной активности

Изучение мутагенной активности химических веществ осуществляется в опытахin vitro на прокариотических и эукариотических клетках, путем непосредственного изучения степени повреждения ДНК, и выявления хромосомных аберраций у животных, подвергшихся действию токсикантов.

Исследования в опытах на прокариотах. Тест Эймса

В основе теста, разработанного Брюсом Эймсом, лежит способность мутагенов вызывать обратную мутацию измененного штаммаSalmonella typhimurium, неспособного к биосинтезу гистидина. Микроорганизмы данного штамма не растут в среде, не содержащей гистидин, однако под влиянием мутагенов вновь приобретают эту способность, свойственную исходному штамму сальмонелл (обратная мутация). В настоящее время созданы специальные штаммы, позволяющие выявлять мутации типа "замещение основания" (штамм ТА-1531) и типа "сдвиг цепи нуклеотдидов" (штамм ТА-1537, ТА-1538).

Тест осуществляется на суспензии бактериальных клеток в расплавленном при 45⁰ агаре. В инкубационную среду (не содержащую гистидин) добавляют токсикант. К части проб добавляют также фракцию микросом, выделенных из гепатоцитов крыс, предварительно обработанных полихлорированными бифенилами, с целью индукции цитохромовР-450 (фракцияS-9). Смеси разливают по чашкам Петри. Число бактерий, приобретших вследствие обратной мутации способность синтезировать гистидин, оценивают путем подсчета колоний, развившихся в инкубате. Исследуемое вещество оценивается в нескольких концентрациях (установление дозовой зависимости эффекта). В итоге получается информация о наличии мутагенности у исходного вещества (среды без фракцииS-9) и его метаболитов (среды, содержащие фракциюS-9). Недостатком метода является сложность получения количественных характеристик мутагенной активности обследуемых веществ для млекопитающих и человека.

В настоящее время тестирование проводят и на других биологических объектах (прямая и обратная мутацияEscherichia coli,прямая мутация сальмонелл).

Исследования в опытах на клетках млекопитающих

Первоначально считалось, что культуры клеток млекопитающих будут идеальным объектом для изучения мутагенной активности токсикантов. Однако в процессе работы, вскрылись обстоятельства поколебавшие эти представления. Прежде всего клетки многих тканей трудно культивировать, у многих из них практически отсутствует способность к клонированию, метаболическая активность клеток недостаточна. В настоящее время в исследованиях предпочтение отдают культурам клеток перевиваемых линий (например, овариальные клетки китайского хомячка, клетки мышиной лимфомы и т.д.). Однако чувствительность этих клеток к ксенобиотикам уже отличается от чувствительности клеток первичных тканевых культур.

Исследования по оценке мутагенности обычно проводят, изучая изменения резистентности клеток к: 8-азагуанину или 6-тиогуанину (определяется активностью гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы - ГГФРТ); бромдезоксиуридину или трифтортимидину (определяется активностью тимидинкиназы - ТК); оуабаину (определяется активностьюNa/К-АТФазы).

ГГФРТ регулирует инкорпорацию пуринов из среды в клетку. Мутация локуса ДНК, ответственного за синтез энзима, приводит к угнетению ферментативной активности, прекращению транспорта пуринов в клетку, в том числе и их токсичных аналогов. Мутировавшие клетки выживают в среде, содержащей аза- и тиогуанины.

ТК активирует транспорт пиримидинов. Мутация лкуса ДНК, ответственного за синтез ТК, делает клетку не чувствительной к токсическому действию токсичных аналогов пиримидина.

Оуабаин убивает клетки, взаимодействуя сNa/К-АТФазой. Мутация локуса, ответственного за синтез этого энзима изменяет его сродство к токсиканту, увеличивает резистентность клетки к яду.

Наиболее часто используется модель мутации ТК локуса в опытах с культурой клеток мышиной лимфомы (иногда с добавлением в инкубационную средуS-9 фракции гепатоцитов). После воздействия исследуемого токсиканта оценивается количество клеток, способных образовывать колонии в среде, содержащей бромдезоксиуридин.

В настоящее время описано множество других тест-объектов, на которых можно проводить подобные исследования.