Продуценты и их культивирование

АЗОТИСТЫЕ ВЕЩЕСТВА

Азотистые вещества ячменя представлены в основном высокомолекулярными соединениями — белками, в меньшей степени —низкомолекулярными веществами органической и неорганичес­кой природы.

БЕЛКИ

Белковые вещества ячменя играют важную роль в технологичес­ких процессах пивоварения и влияют на качество готового пива: его вкус, цвет, пенистость и стойкость при хранении. Продукты гидро­лиза белков — пептиды и аминокислоты — необходимы для пита­ния дрожжей при брожении, они участвуют в сложных процессах метаболизма дрожжевой клетки.

Белки представляют собой длинные цепи остатков аминокислот, соединенных между собой пептидными связями (-СО-NH-), и состоят из следующих элементов: углерода, водорода, кислорода, азота и серы. Кроме того, во многих белках содер­жатся также Fe²⁺, Fe³⁺, Со2+, Ca2+, Mg2+ и др. К аминокислотам, со­ставляющим основу белков, относятся следующие:

аланин, валин, лейцин, изолейцин, глицин, фенилаланин, арги­нин, лизин, гистйдин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты, се­рии, треонин, тирозин, триптофан, цистеин, цистин, метионин, пролин, оксипролин.

Пептидные связи в белках образуются при взаимодействии сс-аминогруппы одной из аминокислот с ос-карбоксильной группой другой с отщеплением воды.

На боковых цепях аминокислот находятся обычно важнейшие функциональные группы белков: сульфгидрильная — SH; дисульфидная – S-S-; аминная — NH2; карбоксильная — СООН; гидроксильная — ОН и т. д. Эти группы обусловливают реакционную способность белка и его отдельных участков. В ячмене белки, как правило, соединены с крахмалом, полисахаридами, полифенола­ми, ионами металлов и др.

Белки легко осаждаются минеральными кислотами: салицило­вой, пикриновой, фосфовольфрамовой и фосфомолибденовой, а также солями тяжелых металлов. С рядом соединений они дают ха­рактерные реакции: биуретовую, ксантопротеиновую и т. д. На этом основаны многие количественные и качественные методы опреде­ления белка. Белки обладают способностью связывать значитель-

ные количества воды — гидратироваться. Процесс гидратации со­стоит в связывании дипольных молекул воды с ионными группами в белках.

Форма белковой молекулы может быть весьма различной: от ша­рообразной до вытянутой. В первом случае — это глобулярные бел­ки, во втором фибриллярные. Глобулярные белки (основная группа белков) имеют молекулярную массу 104—105, размер 1,5—6,0 нм. Белки молекулярной массой 105 содержат 800—850 аминокислот­ных остатков, длина каждого остатка составляет приблизительно 0,35 нм. Пространственная конфигурация белков определяет их биологическую активность, лежит в основе ферментативных, гор­мональных и других свойств. Различают четыре уровня простран­ственной конфигурации белковой молекулы:

1. Первичная — соединение аминокислот в линейной цепи.

2. Вторичная — пространственное расположение полипептид­ной цепи в виде ос-спирали, р-складчатого слоя.

3. Третичная — специфическое укладывание ос-спирали в виде глобулы или фибрилл.

4. Четвертичная — соединение нескольких частиц белка с тре­тичной структурой в одну укрупненную.

Наличие всех видов структур у белков необязательно. Часто от­сутствует четвертичная, может быть нарушена спиралевидная кон­фигурация цепей либо третичная структура.

Поддержание характерной пространственной макроструктуры частиц белка осуществляется за счет взаимодействий участков це­пей и образования между ними поперечных связей: дисульфидных, гидрофобных, электростатических, водородных (рис. 3).

Образование дисульфидных мостиков происходит так. В присут­ствии солей железа или других катализаторов тиоловая группа —SH цистеина в белках легко окисляется с образованием дисульфидной группы —S—S—. В молекуле белка два остатка цистеина могут об­разовывать ковалентную связь в виде дисульфидной связи. Дисуль-фидные связи нестабильны и легко подвергаются перегруппиров­кам.

Формирование структуры биологических макромолекул кроме водородных связей определяется гидрофобными связями. Именно от последних зависят те реальные формы, которые принимают мак­ромолекулы белков. В отличие от водородных гидрофобные связи неполярные и возникают между боковыми группами белков, имею­щих углеводородную природу, без участия воды. Молекулы воды как бы выталкиваются из той сферы, в которой возникает гидро­фобное взаимодействие. К таким взаимодействиям способны ос­татки валина, лейцина, изолейцина, фенилаланина. Гидрофобные связи, как и водородные, имеют низкую величину энергии, но если их число достаточно велико, то они способны придать большой мо­лекуле устойчивую структуру. При комнатной температуре другие молекулы не могут нарушить эту структуру, но по мере повышения температуры возрастающие сила молекулярных столкновений и энергия внутримолекулярных колебаний легко вызывают разрыв как водородных, так и гидрофобных связей.

Нарушение пространственной структуры белка называется дена­турацией. Она бывает физической — под действием на белок нагре­вания, облучения (ультразвук, ультрафиолетовые лучи), сильного встряхивания, растирания; химической — под действием кислот, ще­лочей, органических растворителей, минеральных солей и т. д.

Таким образом, денатурация белка — это изменение простран­ственного расположения пептидных цепей в молекуле белка, кото­рое возникает вследствие разрыва слабых связей при действии дена­турирующих факторов. При этом в разной степени разрушаются вторичная, третичная и четвертичная структуры белка.

Все белки по особенностям первичной структуры разделяют на две группы: протеины, или простые белки, состоящие только из ос­татков аминокислот; протеиды, или сложные белки, — соединения простого белка с веществом небелковой природы (простетической группой).

Протеины в зависимости от степени растворимости разделяют на альбумины, глобулины, проламины, глютелины.

Альбумины растворяются в воде; глобулины в воде нераствори­мы, но растворяются в водных растворах некоторых солей; прола­мины нерастворимы в воде и солевых растворах, но растворяются в

60—80%-ном этиловом спирте; глютелины растворимы только в ра­створах щелочей. К протеинам относят также фосфорпротеины, протамины, протеиноиды.

Фосфопротеины — это белки, в которых фосфорная кислота связана сложноэфирной связью с оксигруппами серина и треонина. Протамины отличаются небольшой молекулярной массой и содер­жанием на 80 % щелочных аминокислот — аргинина, гистидина, лизина. Протеиноиды характеризуются высоким содержанием серы, фибриллярностью, нерастворимостью.

Протеиды в зависимости от химической природы простетичес­кой группы разделяют на липопротеиды, гликопротеиды, хромопро-теиды и нуклеопротеиды. В качестве простетической группы ли­попротеиды содержат жироподобные вещества — липоиды, гли­копротеиды — углевод, хромопротеиды — пигменты, нуклеопроте­иды — нуклеиновую кислоту.

Липопротеиды в большом количестве содержатся в протоплазме клеток. Типичный хромопротеид — гемоглобин. Гликопротеидами являются многие оксидоредуктазы. Нуклеопротеиды — особенно важная группа сложных белков, играющих громадную роль в жиз­недеятельности организма. Они сосредоточены преимущественно в клеточных ядрах. Белки ферментов зачастую также содержат про-стетические группы.

Когда небелковый компонент фермента обусловливает специ­фичность ферментативной активности, простетические группы на­зываются коферментами, а белковая часть — акоферментом. Это, как правило, оксидоредуктазы, и окислительно-восстановитель­ные функции в них выполняет простетическая группа в виде азоти­стого гетероцикла. Кофермент часто является витамином или его производными.

8

Белки эндосперма ячменя в основном относятся к протеинам и характеризуются следующими показателями (табл. 4).

4. Характеристика фракций белка ячменя

Лейкозин (альбумин). Это нейтральный белок, содержит в значи­тельном количестве серу (1,6-2,2 %), водные растворы его начина­ют коагулировать при 59 "С, состоит из 16 компонентов.

Эдестин (глобулин). Различные фракции его локализуются в раз­личных частях ячменя: у — в зародыше, а и (3 — в алейроновом слое. (3-Фракция наибольшая по содержанию среди глобулинов — 50— 80 %. Во время солодоращения количество (3-фракции не изменя­ется, а — несколько уменьшается, у — уменьшается значительно, 5-фракции в солоде уже нет. Количественное содержание фракций в глобулине: а — 3,5; |3 — 3,5—6; у— 2,5 (% общего содержания гло­булина). р-Глобулин — это гетерогенная смесь из 20 компонентов, характеризуется высоким содержанием аспарагиновой кислоты, аланина, глицина, лизина и аргинина.

Глобулин более устойчив к нагреванию и труднее, чем альбумин, коагулирует из растворов. Он начинает коагулировать только при 90 °С. Так как он растворим в слабых солевых растворах, то сначала переходит в сусло, а затем и в готовое пиво, в определенных услови­ях вызывая его помутнение. Глобулин содержит серу в виде группы —SH; очень реакционноспособный белок, что также ускоряет его выпадение в осадок в готовом пиве.

Глютелин. При гидролизе сильными кислотами глютелин обра­зует большое количество глютелиновой кислоты и лейцина. Нали­чие дисульфидных связей делает его сходным по свойствам с глобу­лином, но растворяется глютелин только в присутствии восстано­вителей. В последнее время показано, что извлечь глютелин можно не только с помощью едких щелочей, но и растворов редуцирую­щих веществ, например аскорбиновой кислоты. Из глютелина и гордеина в ячмене может образовываться клейковина — белковый комплекс, способный активно поглощать воду, набухать, увеличи­ваясь в объеме, и превращаться в упругую массу, которая растягива­ется и пружинит, как резина. Пивоваренные ячмени с низким со­держанием белка обычно не содержат клейковины.

Гордеин (проламин). Он содержит до 8 фракций, основные из ко­торых а— 33,7 %; (Зиу— 39,1;5ие — 49 %. Основные аминокисло­ты проламинов — глутаминовая кислота и пролин. Гордеину сопут­ствуют всегда антоцианогены, соединенные с ним адсорбционны­ми и химическими связями. Степень связывания с отдельными фракциями гордеина неравномерна: с 5 + е — 1,8—2,7 %, с а —0,5— 1,0 %. С увеличением содержания белка в ячмене особенно возрас­тает количество гордеинов. Отмечено их присутствие в помутнении готового пива.

Весь белок распределен в зерне ячменя следующим образом: 4— 5 % всего белка ячменя сосредоточено в оболочке, 84—86 — в эн­досперме и 13—15 % — в зародыше. Часть белка эндосперма прочно связана с клеточными стенками крахмальных зерен, причем у вы-сокобелковистых ячменей эта связь гораздо более прочная, чем у обычных пивоваренных ячменей

9

ПОЛИФЕНОЛЬНЫЕ ВЕЩЕСТВА

КЛАССИФИКАЦИЯ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

Фенольными веществами называется ряд веществ, содержащих в своей структуре ароматические кольца с гидроксильной группой, а также их функциональные производные. Фенольные соединения, в ароматическом кольце которых имеется более одной гидроксиль­ной группы, именуют полифенолами.

Известно более 1000 разнообразных природных фенольных со­единений. На рис. 4 приведена классификация фенолов.

По химической структуре все фенольные соединения можно разделить на три основные группы: с одним ароматическим коль­цом, с двумя ароматическими кольцами, полимерные соединения.

Простые фенольные соединения с одним ароматическим коль­цом представлены: пирокатехином (1,2-диоксибензолом), резор­цином (1,3-диоксибензолом), гидрохиноном (1,4-диоксибензо-лом), флюроглюцином (1,3,5-триоксибензолом), оксигидрохино-ном (1,3,4-триоксибензолом), пирогаллолом (1,2,3-триоксибензо-

лом).            

Группа фенолкарбоновых кислот представлена оксибензойны-ми кислотами: протокатеховой, галловой, ванилиновой, и-окси-бензойной и сиреневой. Они обычно присутствуют в связанной с другими соединениями форме. Например, галловая кислота в рас­тениях находится часто в виде л*-дигалловой кислоты.

Связь между гидроксильной группой одной молекулы фенолкар-боновой кислоты и карбоксильной группой другой называется деп-сидной, а соединения, содержащие такие связи, — депсидами.

Третья группа фенолов с одним ароматическим ядром разделя­ется на две подгруппы: оксикоричные кислоты и кумарины. В рас­тениях часто встречаются эфиры оксикоричных кислот с алифати­ческими и гидроароматическими кислотами, например хлорогено-вая кислота.

Фенольные соединения с двумя ароматическими кольцами представлены тремя типами соединений: флавоноидами, изофла-воноидами, ротеноидами.

Молекула флавоноида содержит два бензольных кольца и одно гетероциклическое кислородсодержащее пирановое или пироно-вое кольцо. Их можно рассматривать как производные флавана. К ним относится фенилхроман. Флавоноиды могут быть разбиты на 6 основных подгрупп по степени окисленности (или восстановлен­ное™) гетероциклического фрагмента. Разнообразие флавоноидов достигается за счет различного замещения функциональных групп в ароматических кольцах А и В (например, в разных положениях могут присоединяться группы—ОН, —ОСН₃, —СН₃), а также нали­чия асимметрических атомов углерода и способности образовывать гликозиды с разными моно-, ди- и трисахаридами.

Катехины — наиболее восстановленная группа флавоноидов. Это бесцветные вещества, легко окисляющиеся и склонные к поли­меризации; последнее определяет их решающую роль в помутнени­ях пива. Они в значительном количестве присутствуют в ячмене и солоде. Катехины — родоначальники конденсированных полифе-нольных веществ, при окислении приобретают различную окраску. Окислительная конденсация катехинов протекает по следующей схеме:

Лейкоантоцианы — очень неустойчивые соединения. В ячмене находятся в достаточно большом количестве. При кислотной обра­ботке легко переходят в окрашенные антоцианидины.

К ним относятся антоцианогены — интенсивно окрашенные со­единения. В растениях они содержатся в виде гликозидов-антоциа-нов.

Антоцианы — красящие вещества растений. Окрашивают пло­ды, листья, лепестки цветов в самые разнообразные оттенки — от розового до черно-фиолетового. Строение установлено в 1913— 1916гг. крупнейшим немецким биохимиком Р. Вильштеттером. Все антоцианы содержат в гетероциклическом кольце четырехва­лентный кислород (оксоний) и благодаря этому легко образуют соли, например хлориды.

Влияние характера заместителей в кольце В на окраску соедине­ния показано в табл. 7.

                                              '

В зависимости от рН среды изменяется окраска антоцианиди-нов. Соли катионов этих соединений окрашены в красный цвет с оттенками, щелочные соли — в синий цвет. Увеличение числа гидроксильных групп в кольце В антоцианидинов усиливает ин­тенсивность синей окраски, а метоксильных групп — красной ок­раски. Поэтому полифенолы широко используются как индикато­ры.

10

ЖИРЫ

Ячмень содержит растворимые в эфире жиры (липиды) в коли­честве около 2 % по сухому веществу. Две трети жиров ячменя нахо­дится в алейроновом слое и одна треть — в зародыше. При солодоращении часть жиров расходуется при обмене веществ на дыхание, но большая их часть переходит в дробину. При правильной очистке зерна в сусло попадает лишь незначительная часть жиров. Присут­ствие жиров в сусле нежелательно, так как они отрицательно влия­ют на пенообразование, стабильность и вкус пива.

Среди жиров ячменя только незначительная (менее 0,1 %) часть присутствует в виде свободных жирных кислот, из которых 52 % приходится на долю линоленовой, 28 — на долю олеиновой и 11 % — на долю пальмитиновой кислоты. Большая часть жиров яч­меня представлена глицеридами: эфирами глицерина и жирных кислот. Глицерин может образовывать с жирными кислотами моно-, ди- и триглицериды, которые составляют соответственно 0,5, 3 и 95 % общего содержания жиров. Во время прорастания яч­меня происходит гидролитическое расщепление глицеридов на на­званные компоненты.

К жироподобным веществам ячменя — липоидам — относятся α-и β-фосфолипиды, такие, как соответственно кефалин и леци­тин. В этих соединениях глицерин этерифицирован двумя жирны­ми кислотами и фосфорной кислотой, которые связаны также с аминоспиртами — холином и коламином. Лецитин и кефалин вы­полняют в зерне важную физиологическую функцию, связанную с проницаемостью клеточных стенок.

Другим компонентом ячменного жира является воск. Он пред­ставляет собой сложный эфир жирных кислот и высокомолекуляр­ных одноатомных спиртов.

Около половины фосфатов присутствует в ячмене в виде фитина, который относят также к липидам. Он состоит из циклического са­хара инозита и остатков фосфорных кислот. На долю фитина (липоинозитгексафосфата) приходится около 0,9 % сухого вещества яч­меня.

В ячменном зерне фитин содержится в виде солей кальция и маг­ния. Как фосфатный остаток, так и ионы магния имеют большое значение для прорастания зерна. В процессе прорастания зерна в результате гидролиза фитина образуется основная часть кислотных составляющих, а именно первичные фосфаты, благодаря которым при солодоращении, а затем в сусле и пиве поддерживается опреде­ленный уровень рН.

В ячмене жиры содержатся как в свободном состоянии, так и в связанном с белками и углеводами.

.

11

2.5. МИНЕРАЛЬНЫЕ ВЕЩЕСТВА

Содержание минеральных компонентов в ячмене составляет 2 4—3,3 %. Зола ячменя имеет следующий состав (%): Р2О5 — 35,1; Cl-1,02; СаО - 2,64; SO3-1,8; К,0-20,92;   MgO - 8,83; • Si02- 25,91; Na,0- 2,89; Fe2O3-"U9.

Отдельные ионы находятся в связанном с органическими веще­ствами состоянии. Остатки фосфорной кислоты входят в состав фи­тина, фосфатидов, нуклеиновых кислот. При ферментативном гид­ролизе этих соединений освобождается фосфорная кислота. В боль­шом количестве в ячмене содержится калий. Кремниевая кислота находится главным образом в оболочке зерна и связана с целлюло­зой. Большая часть минеральных веществ сосредоточена в зароды­ше: 6—6,5 % массы зародыша.                                                    

Витамины являются естественной составной частью растений, в том числе зерна ячменя (табл. 5).

5. Витамины ячменя

Важнейшей функцией витаминов является их вхождение в состав биохимических систем клеток, а именно коферментов (табл. 6).

6. Важнейшие клеточные коферменты

Витамин В1 является частью фермента пируватдекарбоксилазы, участвующей в углеводном обмене; рибофлавин входит в состав фла-виновых ферментов, обеспечивающих нормальное клеточное дыхание. Витамин В6 — составная часть аминотрансфераз, катализируюших декарбоксилирование аминокислот и реакцию переаминирования. Витамин РР входит в состав анаэробных дегидрогеназ.

61

19

Продуценты и их культивирование

В качестве продуцентов ферментов используются культуры предс­тавителей различных таксономических групп - бактерий, актиномицетов, микроскопических и высших базидиальных грибов.

К микроорганизмам - продуцентам ферментов предъявляются требования: наличие высокой ферментативной активности; преиму­щественный синтез фермента или группы ферментов, превращающих определенный субстрат; генетическая стабильность по признаку синтеза фермента или ферментов; достаточно высокая скорость роста; способ­ность расти на средах с доступными и недорогими источниками питания.

Важнейшим качеством продуцента фермента является его генети­ческая стабильность, которая выражается в способности сохранять на протяжении многих поколений определенный уровень биосинтеза фер­мента в соответствующих условиях. Генетическая стабильность присуща природным штаммам микроорганизмов, прошедшим длительный путь естественного отбора. Однако в практике чаще используют штаммы, полученные искусственной селекцией, с применением мутагенов. Такие штамы обладают высокой изменчивостью, нестабильностью признаков. Необходима постоянная селекционная работа по поддержанию полезных признаков штаммов на определенном уровне. При этом опираются на известную корреляцию внешних, морфологических и физиолого-биохимических признаков микроорганизмов. Контроль за появлением нежела­тельных форм ведут как путем их визуального обнаружения при рассевах штаммов, так и с помощью серологических методов, выявляя неактивные варианты по их реакции со специфическими сыворотками.

Неустойчивость генетических признаков — причина частой смены продуцентов ферментов в условиях промышленного производства. Смена штамма влечет за собой изменение ферментативного комплекса препа­ратов, физико-химических и каталитических свойств отдельных компо­нентов. Это может выражаться в изменении оптимальных условий дейс­твия ферментов (рН, температуры), термо- и рН-стабильности, устой­чивости к действию ингибиторов и к протеолизу, способности атаковать нативный или модифицированный субстрат, соотношения продуктов реак­ции, предельной степени превращения субстрата. Изменение отражается на технологических свойствах фермента, его поведении в процессах очистки и выделения, что влияет на состав и свойства ферментативного комплекса препарата. Изменение состава и свойств ферментативных комплексов наблюдается не только при смене штаммов-продуцентов, но и при появлении нехарактерных морфологи­ческих вариантов, образующихся в процессе естественной изменчивости культур микроорганизмов.

К технологическим характеристикам продуцентов ферментов следует отнести их скорость роста, устойчивость к инфекции, отношение к источникам питания и другим внешним факторам. Культивирование продуцентов ферментов проводится в условиях стерильности (глубинный процесс) или максимально возможного приближения к ним (твердо­фазный процесс). Очевидно, что сохранение чистоты культуры не менее важно, чем генетическая стабильность продуцента. Создание стериль­ности облегчено при непродолжительном культивировании продуцента и наличии у него естественных механизмов защиты от инфекции. Стабиль­ность уровня биосинтеза ферментов выше у микроорганизмов, способных развиваться в широком диапазоне изменения внешних факторов, таких как концентрация источников питания, реакция среды, уровень аэрации и др. Исходя из экономических соображений, предпочитают использовать дос­тупные и недорогие источники питания.

Ферментная промышленность выпускает большой ассортимент препаратов микробного происхождения, продуцентами которых являются представители различных таксономических групп.

Преобладающим способом культивирования является глубинный, основанный на выращивании продуцентов в стерильных жидких средах с принудительной аэрацией и перемешиванием среды, при автоматическом регулировании параметров процесса (температуры, рН среды, ее редокс -потенциала, концентрации растворенного кислорода и т.д.).

применяется твердофазный способ культивиро­вания, когда культуры продуцентов выращивают на увлаженных и простерилизованных твердых средах, таких как отруби, свекловичный жом, измельченное целлюлозосодержащее сырье, солодовые ростки и др. Твердофазное культивирование сложнее регулировать, чем глубинный процесс. Преимуществом твердофазного процесса является то, что усло­вия культивирования продуцентов максимально приближены к естествен­ным, в которых полностью реализуется биопотенциал микроорганизмов.

Глубинное культивирование используется как для аэробных, так и для анаэробных продуцентов, твердофазное - только для аэробных, именно для микроскопических и высших базидиальных грибов.

24

Критическая влажность зерна и семян. Чем зерно влажнее, тем интенсивнее оно дышит. Интенсивность дыха­ния очень сухих зерен (пшеницы, ржи, ячменя, овса, кукурузы и бобовых влажностью до 11...12%) ничтожна. Наоборот, очень сырое зерно (влаж­ностью более 30%), находящиеся в неохлажденном состоянии при свобод­ном доступе воздуха, теряют 0,05...0,2 % сухих веществ в сутки.

Такое положение хорошо объяснимо. Только при появлении в зерне или семенах свободной влаги резко возрастают актив­ность гидролитических и дыхательных ферментов, интенсивность дыхания, а, следовательно, и расход сухих веществ. Влажность, при которой в зерне появляется свободная влага и резко возра­стает интенсивность дыхания зерна и семян, называют крити­ческой.

 Величины критической влажности зерна и семян различных культур следующие (%):

Зерно и семена основных злаковых культур влажностью до 14 % (ниже критической) устойчивы. Их можно хранить в насы­пи большой высоты (до 30 м и более). Зерно средней сухости, находящееся на грани критической влажности, дышит примерно в два — четыре раза интенсивнее сухого, но у него малый газо­обмен, поэтому такое зерно достаточно устойчиво при хранении. Влажное зерно дышит в четыре — восемь раз интенсивнее сухо­го, сырое (влажностью свыше 17 %) — в 20...30 раз энергичнее сухого. По мере дальнейшего увлажнения зерна и накопления в нем свободной воды интенсивность дыхания нарастает. Приводи­мые почти всеми авторами данные о большой интенсивности дыхания зерна и семян при высокой влажности, в сущности, характеризуют суммарную интенсивность дыхания зерновой массы, так как в данных условиях активно дышат и размножа­ются микроорганизмы.