МЕМБРАННЫЕ МЕТОДЫ ОЧИСТКИ И КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ ФЕРМЕНТНЫХ РАСТВОРОВ

В зависимости от движущей силы процесса мембранные методы классифицируются на диффузионные - диализ (движущая сила - разность концентраций по обе стороны мембраны), электромембранные - электродиализ (разность электрических потенциалов), баромембранные - обратный осмос, ультрафильтрация, микрофильтрация (разность давлений). Все эти процессы применяются для переработки ферментных растворов, выбор их определяется целью переработки: для очистки от низкомолекулярных примесей при небольших производительностях - диализ, для обессоливания в интенсивных условиях - электродиализ, для глубокой очистки от примесей с одновременным концентрированием - ультрафильтрация и т. д. Рассмотрим подробнее сущность и технические решения каждой группы процессов, что (дет возможность в дальнейшем выбрать оптимальный вариант для любой конкретной задачи.

Диализ

Диализ - это первый изученный и промышленно развитый мембранный процесс, поскольку для его осуществления не нужна сложная аппаратура и специальные мембраны. Сущность диализа в том, что если два раствора с различной концентрацией какого-либо компонента разделить мембраной, то начнется естественный процесс диффузии, достигающий равновесия при выравнивании концентраций этого компонента с обеих сторон мембраны. Интенсивность переноса вещества Q_В через мембрану определяется коэффициентом диффузии этого вещества в материале мембраны D_B, и пропорциональна разности концентраций ΔС. Эту зависимость можно записать в виде сравнения: Q_В = D_B • S • ΔС, где S - площадь мембраны.

Соответственно, чем больше различие в величинах коэффициентов диффузии двух компонентов, находящихся в растворе, тем лучше они разделяются мембраной. Понятно, что белковые молекулы (высокомолекулярные вещества) и органические и неорганические низкомолекулярные молекулы и ионы сопутствующих компонентов (сахара, аминокислоты, минеральные соли и т. п.) в силу огромных различий в коэффициентах диффузии практически полностью разделяются мембраной.

В качестве диализных мембран используют обычно пленки из целлюлозы - целлофан, купрофан, а также из других синтетических полимеров. Процесс проводят либо по проточной схеме (рис. 1.53, а), когда исходный раствор ферментов постоянно прокачивают с одной стороны мембраны, а диализирующую жидкость (обычно воду) - с другой ее стороны, либо по полупроточной схеме, когда раствор ферментов помещают на определенное время в мешочки из диализной мембраны, которые постоянно омываются водой. Таким образом можно удалить основную массу сопутствующих низкомолекулярных примесей и повысить активность ферментных растворов в пересчете на сухое вещество в несколько раз.

Процесс диализа применительно к очистке растворов ферментов имеет ряд существенных недостатков. Во-первых, при диализе возможна «потеря» фермента в результате вымывания ионов металлов, входящих в состав молекулы фермента, или стабилизирующих фермент соединений, или фрагментов самого фермента, например, простетической группы его. Во-вторых, при диализе против обычной водопроводной воды может происходить потеря активности фермента в результате попадания из воды в раствор фермента ионов металлов - ингибиторов фермента. Следует также отметить, что в процессе диализа одновременно с очисткой происходит сильное разбавление ферментного раствора из-за проникновения воды под действием сил прямого осмоса в диализуемый раствор (см. рис. 1.53). Объем продиализованного раствора увеличивается примерно на 20-25%, а если учесть, что происходит активное удаление балластных веществ, то в результате диализа получают очень разбавленные ферментные растворы. Поэтому сейчас этот метод очистки ферментных растворов от балластных веществ в ферментной промышленности почти не используется. Этот метод иногда применяют в лабораторных исследованиях и при получении высокоочищенных ферментных препаратов.

Электродиализ

Если в процессе очистки ферментов стоит задача удалить из раствора электролитные примеси, т. е. органические и минеральные ионы, иногда пользуются электродиализом. Сущность этого мембранного метода в том, что перенос ионов через мембрану интенсифицируют с помощью постоянного электрического поля, а мембраны изготавливают из специальных ионо-обменных материалов на основе синтетических полимеров. Принципиальная схема работы электродиализаторов представлена на рис. 1.54.

Электрический потенциал к аппарату подводится через два электрода, размещенных в соответствующих электродных камерах. Обе камеры отделены от рабочей обессоливающей камеры, куда подается исходный pacтвор, ионообменными мембранами, со стороны катода - анионообменной, со стороны анода - катионообменной. При работе аппарата катионы под действием постоянного электрического поля смещаются к аноду, встречают на пути катионообменную мембрану, проходят через нее в электродную камеру и в виде слабого раствора щелочи выводятся из аппарата. Соответственно ведут себя и анионы, выходя из аппарата в виде слабого раствора кислоты. Обессоленный раствор ферментов (диализованный раствор) выводится из рабочей камеры.

Электродиализный метод осуществляется всегда в непрерывном режиме (см. рис. 1.54, б) и существенно более энергоемок, чем диализ. Применительно к обработке ферментных растворов он имеет те же недостатки. Кроме того, электродиализ нельзя применять при выделении ферментов, имеющих, например, четвертичную структуру, которая формируется с участием ионов металлов, а также при выделении металлоферментов, которые, как правило, теряют активность при электродиализе (α-амилазы, β-галактозидазы и др.).

Баромембранные методы

Часто баромембранные методы разделения жидких смесей относят к процессу обычной фильтрации, но они лишь внешне похожи благодаря тому, что движущей силой является разность давлений. В действительности с помощью полупроницаемых мембран разделяются истинные растворы, т. е. гомогенные системы, в то время как фильтрованием можно разделить лишь суспензии, т. е. твердую фазу отделить от жидкой.

Вместе с тем, считая мембранные методы фильтрованием на молекулярном уровне, можно построить условный спектр фильтрации, разместив мембранные методы - обратный осмос, нанофильтрацию, ультрафильтрацию и микрофильтрацию - в некоторый ряд и дополнив его обычной механической фильтрацией по порядку увеличения размера и молекулярной массы задерживаемых частиц (см. рис. 1.55).

Сегодня баромембранные методы получили широкое распространение в биотехнологической, пищевой, фармацевтической, химической промышленности. В частности, ни одно современное производство ферментов не может уже обойтись без ультрафильтрационной очистки и концентрирования продукта.

Физико-химический механизм. Растворение вещества в растворителе возможно только тогда, когда они имеют сродство друг к другу, т.е. когда на уровне межмолекулярного взаимодействия происходит сольватация молекулами растворителя молекул или ионов растворяемого вещества. Когда речь идет о водных растворах, процесс называется гидратация. Поскольку молекула воды представляет собой крохотный диполь, ее энергия связи с частицей растворимого вещества тем больше, чем больший заряд несет эта частица на себе. Понятно, что чем больше заряд иона, тем больше количество молекул воды окажется связанным с ионом в виде многослойной гидратной оболочки.

Именно образованием гидратных оболочек объясняется явление, которое называется прямой осмос (рис. 1.56). Если раствор любого вещества отделить полупроницаемой мембраной от объема чистого растворителя, то мы будем наблюдать односторонний перенос молекул растворителя (в данном случае воды) в раствор, где они достраивают гидратные оболочки. Чем выше концентрация растворенного вещества слева, тем больше молекул воды должно пройти через мембрану в раствор. Количественно этот перенос выражается величиной осмотического давления (Р_О):

Р_О= C R Е ,

где:

С - массовая концентрация растворенного вещества;

R - газовая постоянная;

Т - абсолютная температура.

Если осмотическое давление (Р_О) больше гидравлического (Р_r), то происходит прямой осмос, если Р_О = Р_r, то диффузия через мембрану прекращается.

Если же теперь к раствору приложить рабочее давление, превышающее осмотическое, т. е. Р_r > Р_О то начнется перенос молекул воды слева направо, т. е. будет происходить дегидратация раствора, концентрирование растворенного вещества и получение чистой воды в правой половине сосуда. Это механизм называется обратным осмосом.

Обратный осмос по механизму близок к ультрафильтрации. Ультрафильтрация год от года все шире используется в технологии ферментных препаратов. Весьма убедительны данные, приводимые фирмой «Амикон корпорейшн» (США) о преимуществах очистки и концентрирования методом ультрафильтрации (см. табл. 1.12).

Таблица 1.12

Действительно, из таблицы следует, что ультрафильтрация обладает способностью не инактивировать ферменты и требует минимальные энергозатраты.

Скорость ультрафильтрации будет тем выше, чем больше разница между рабочим гидравлическом (Р_r) давлением и осмотическим.

Однако между процессами обратного осмоса и ультрафильтрации все же есть различия. Так, при обратном осмосе разделение низкомолекулярных веществ происходит при рабочем давлении до 0,7-14 МПа, так как осмотическое давление Р_О в этих растворах велико. При обратном осмосе используются мембраны с очень маленькими порами (от 1 • 10~4 до 2 • 10~3 мкм). При ультрафильтрации происходит разделение высоко- и низкомолекулярных соединений, и целью этого процесса является получение концентрата высокомолекулярных соединений (например, ферментов). Рабочее давление в этом случае низкое (от 0,07 до 0,7 МПа), так как Р_О небольшое. Величина пор мембран значительно больше - от 3 • 10~3 до 150 • 10~3 мкм.

Однако названные различия достаточно условны. Механизм процессов обратного осмоса и ультрафильтрации пока остается недостаточно ясным.

Для математического описания процесса мембранного разделения служит модель движения вязкого потока через поры (уравнение Пуазейля) и модель диффузионного массопереноса (закон Фика). Принято считать, что если размер пор мембраны меньше 3 • 10~3 мкм (обратный осмос), то процесс подчиняется закону Фика, если же размер пор больше 3 • 10~3 мкм (ультрафильтрация), то процесс подчиняется уравнению Пуазейля.

В этом и заключается принцип любого баромембранного процесса. Отличия между ними лишь в размерах пор используемой мембраны и в величинах приложенного к раствору давления.

Поскольку осмотическое давление белковых растворов мало, для осуществления процесса достаточно 0,3-0,6 МПа, а размер пор мембраны составляет 10-50 нм. На основе этих знаний каждый может теперь дополнить диаграмму на рис. 1.55 новыми системами.