Иммунно-серологические и аллергологические методы исследования

5.4.1. Реакция преципитации по Асколи

Реакция позволяет в короткие сроки обнаружить сибиреязвенный антиген в экстрактах из струпьев язв больных, органов умерших от сибирской язвы людей, шкур и органов павших животных. Исследованию в реакции Асколи подвергают в том числе и загнивший биоматериал. Для постановки реакции необходимы: преципитирующая сибиреязвенная сыворотка, экстракт из исследуемого материала и сибиреязвенный бактерийный антиген для контроля.

Перед постановкой реакции свежий биоматериал выдерживают в термостате в течение 18-20 ч. Экстрагирование проводят горячим и холодным способами. При этом следует учитывать, что в экстрактах, полученных горячим способом, меньше преципитиногенов.

Для получения экстракта из патологического материала и струпьев горячим способом материал измельчают, заливают 0,9%-м раствором натрия хлорида с 0,3%-м раствором карболовой кислоты в соотношении 1:10 и кипятят в течение 30-40 мин, при холодном способе - оставляют для экстрагирования на 16-18 ч при комнатной температуре. Полученные экстракты фильтруют до полной прозрачности через фильтровальную бумагу или вату, предварительно смоченные 0,9%-м раствором хлорида натрия. В узкие пробирки наливают 0,2-0,3 мл прозрачной сибиреязвенной преципитирующей сыворотки, а затем пастеровской пипеткой осторожно наслаивают на нее такое же количество полученного экстракта. Если реакция положительная, то на границе соприкосновения жидкостей не позднее 15 мин должно появиться мутно-белое кольцо. Реакция оценивается знаком (+). При сомнительной реакции появление кольца наблюдается позднее 15 мин (±). Если кольцо отсутствует, то реакция оценивается как отрицательная (-). Одновременно необходимо ставить три контрольных пробы: преципитирующая сыворотка плюс коммерческий стандартный сибиреязвенный антиген; преципитирующая сыворотка плюс экстрагирующая жидкость; нормальная лошадиная сыворотка плюс коммерческий стандартный сибиреязвенный антиген. Все контроли, кроме первого, должны быть отрицательными.

Исследование кожевенного и мехового сырья на сибирскую язву в реакции преципитации по Асколи проводят в соответствии с "Наставлением по исследованию кожевенного и мехового сырья реакцией преципитации", утвержденным Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 25 мая 1971 г.

Необходимо учитывать, что применяемые в настоящее время различные виды кислот и щелочей для выделки кожевенного сырья могут влиять на результаты реакции преципитации. Оптимальное значение рН экстрактов должно находиться в пределах 6,0-8,0. Кроме того, данный метод характеризуется недостаточно высокой чувствительностью, так как нередко дает отрицательный результат при исследовании заведомо сибиреязвенного материала.

Реакцию Асколи используют как экспресс-метод для обнаружения специфических сибиреязвенных антигенов у исследуемых культур. Для этого в 0,25-0,5 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида ресуспендируют петлю суточной агаровой культуры. Экстрагирование проводят горячим методом, а постановку реакции выше описанным способом. Учет результатов реакции проводят в течение 3 мин.

5.4.2. МФА для выявления специфических антител в сыворотке крови

В исключительных случаях можно проводить поиск противосибиреязвенных антител у больных непрямым МФА. С этой целью используют сыворотку диагностическую антивидовую против иммуноглобулинов человека люминесцирующую сухую. Для получения вегетативной культуры сибиреязвенного микроба используют споры вакцины СТИ, которые засевают на чашку с агаром Хоттингера (рН 7,2) и инкубируют в термостате при (36±1) °С в течение 18-20 ч. После этого готовят суспензию вегетативных клеток на 0,9%-м растворе натрия хлорида, доводя плотность инокулюма до ОСО мутности 10 ед. ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Полученную суспензию тщательно встряхивают и готовят из нее мазки на хорошо обезжиренных предметных стеклах, по 8 мазков на каждом стекле. Мазки высушивают на воздухе, фиксируют 30 мин в спирте с 3% перекиси водорода, вновь высушивают и расчерчивают восковым карандашом. При постановке этой реакции желательно использовать "свежие" мазки, при необходимости их можно хранить в холодильнике в закрытых чашках Петри в течение 3 суток.

Исследуемую сыворотку от больного человека инактивируют на водяной бане при 56 °С в течение 20 мин. В качестве отрицательного контроля используют сыворотку здорового человека, которую обрабатывают аналогичным образом. Затем сыворотки титруют в пробирках или полистироловых планшетах в 0,9%-м растворе натрия хлорида с двукратным шагом, отбирают с помощью пастеровской пипетки, начиная с большего разведения, и наносят капли на мазки с вегетативной культурой сибиреязвенного микроба. Стекла помещают на дно чашки Петри, закрывают крышкой и выдерживают 20-30 мин при 37 °С. Затем мазки промывают дважды по 10 мин в забуференном 0,9%-м растворе натрия хлорида и 10 мин в дистиллированной воде. Стекла сушат на воздухе при комнатной температуре, после чего на мазки наносят люминесцирующую сыворотку против иммуноглобулинов человека в рабочем титре, обозначенном на ампуле. Мазки окрашивают и промывают так же, как и в первом случае. Микроскопию проводят с иммерсионной системой. Для оценки интенсивности свечения используют четырехкрестовую систему. Положительным результатом считается свечение на 3 и 4.

У лиц, больных сибирской язвой, специфические антитела начинают появляться уже с 5-х сут. после начала болезни, и их титр нарастает до 21 и более суток. Увеличение титра антител можно проследить при исследовании парных сывороток с интервалом 5-7 дней. В МФА титры антител могут доходить до 1:640-1:1280, диагностическими считаются титры - 1:16-1:32 и 4-кратное нарастание титров при повторном исследовании.

5.4.3. Реакция непрямой гемагглютинации

Для постановки серологических реакций РНГА (макро- и микрометоды) и РТНГА используется эритроцитарный иммуноглобулиновый диагностикум для выявления сибиреязвенных спор в объектах внешней среды. Исследование материала проводится согласно инструкции по применению.

5.4.4. Кожно-аллергическая проба с сибиреязвенным аллергеном антраксином

Организм больного, переболевшего сибирской язвой и иммунизированного против этой инфекции, обладает свойством отвечать аллергической реакцией в виде гиперемии и инфильтрации кожи на месте введения сибиреязвенного аллергена - антраксина. Эта реакция может появляться уже с первых дней и наблюдается у подавляющего числа больных с конца первой недели заболевания. Аллергическая перестройка организма у переболевших сибирской язвой может сохраняться длительное время, что позволяет использовать антраксин не только для диагноза текущего заболевания, но и для ретроспективной диагностики.

Антраксин вводят с соблюдением всех правил асептики строго внутрикожно в количестве 0,1 мл в нижней трети левого предплечья на внутренней стороне. На месте инъекции должна образовываться беловатая, хорошо ограниченная папула около 0,8 см в диаметре, имеющая вдавление на месте волосяных мешочков. В месте введения антраксина через 8-24 ч учитывается наличие гиперемии и инфильтрата. В зависимости от размеров этих элементов производят оценку пробы, руководствуясь приведенной ниже шкалой (табл.).

Таблица

Оценка результатов пробы с антраксином