Посев на питательные среды, бактериологический метод

5.2.1. Подготовленный для исследования материал ("Подготовка проб к бактериологическому исследованию") засевают на чашки Петри с МПА, агаром Хоттингера (рН 7,2), селективную дифференциально-диагностическую среду с 0,01% натрия фенол-фталеинфосфата (прилож.1.1) и пробирку с МПБ. Для засева одной пробы желательно использовать не менее 5 чашек. Поверхность агара перед посевом должна быть совершенно сухой. Посев необходимо производить с помощью шпателя, предварительно нанося на поверхность агара 1-2 капли (0,1 мл) исследуемого материала. Если материал значительно загрязнен посторонней микрофлорой (почва, корма, смывы с поверхностей и пр.), делают посевы методом истощения, распределяя материал шпателем по поверхности агара с переносом на 2-3 чашки. При исследовании материала, слабо загрязненного посторонней микрофлорой (кровь, пунктаты из карбункула, органы биопробных животных), посев можно проводить петлей без истощения, используя при этом МПА, агар Хоттингера, кровяной агар и МПБ. Посевы помещают в термостат при (36±1) °С на 18-20 ч и при отсутствии роста выдерживают при той же температуре 48 ч.

5.2.2. После суточного роста сибиреязвенного микроба МПБ остается прозрачным, на дне образуется рыхлый осадок в виде "комочка ваты". При встряхивании пробирки бульон не мутнеет, осадок разбивается с трудом на мелкие хлопья. В отдельных случаях в МПБ появляется диффузный рост культуры (легкое помутнение), при встряхивании образуются муаровые волны, на поверхности бульона может наблюдаться рост в виде пристеночного кольца.

Из бульонной культуры делают мазки, окрашивают по Граму и исследуют под микроскопом. В мазках из бульонной культуры обнаруживают типичные цепочки, состоящие из сибиреязвенных палочек, из бульонной культуры с диффузным ростом - отдельные или парно расположенные палочки. Для получения чистой культуры из бульона делают высевы на плотные питательные среды петлей для получения изолированных колоний.

5.2.3. На следующий день плотные питательные среды просматривают визуально и под микроскопом при малом увеличении.

Кроме колоний сибиреязвенного микроба на средах может наблюдаться рост спорообразующих сапрофитов, морфологически трудно отличимых от В. anthracis. Возбудитель сибирской язвы образует плоские матово-серые шероховатые (R-форма) колонии. Центр их иногда затемнен, периферия бахромчатая с локонообразными отростками. Встречаются колонии с менее выраженной шероховатостью и без отростков, которые также подлежат дальнейшей идентификации. Колонии В. anthracis трудно снимаются петлей с поверхности агара, в то время как колонии близкородственных сапрофитов снимаются легко. Для выделения чистой культуры с питательного агара отбирают не менее 10 шероховатых колоний, при отсутствии такого количества - все шероховатые колонии.

Примечание: при оценке морфологии колоний следует учитывать существование редких вариантов сибиреязвенного микроба II типа, формирующих слизистые колонии в SM-форме на обычных питательных средах.

5.2.4. Посевы на селективной дифференциально-диагностической среде с фенолфталеинфосфатом натрия перед просмотром обрабатывают парами аммиака. Для этого в отдельную крышку от чашки Петри помещают фильтровальную бумагу и наливают на нее 1-2 мл аммиака водного (29%-го, концентрированного). Затем чашку с посевами (агаром вверх), без крышки, помещают на несколько секунд (пока не порозовеют колонии сапрофитов) в крышку с аммиаком. Таким образом обрабатывают все посевы. В силу того, что сибиреязвенный микроб не образует или продуцирует фосфатазу слабо, его колонии, как правило, не изменяют своего цвета. Колонии спорообразующих сапрофитов, в том числе и В. cereus, под действием паров аммиака приобретают розовый или красный цвет. С дифференциально-диагностической среды для выделения чистой культуры отбирают визуально и с помощью микроскопа при малом увеличении все колонии, не изменившие своего цвета после обработки парами аммиака или слабо порозовевшие.

5.2.5. Из всех отобранных колоний делают мазки на двух или более предметных стеклах. Мазки фиксируют и окрашивают двумя способами - по Ребигеру (или по Граму) и сибиреязвенной люминесцирующей соматической сывороткой. При просмотре мазков учитывают характерную для сибиреязвенного микроба морфологию (длинные нити, концы палочек обрублены), при окраске люминесцирующими сыворотками - специфическое свечение на 4 или 3. Для идентификации отбирают только колонии чистой культуры, которые состоят из характерных для сибиреязвенного микроба палочек. Их отсевают на секторы МПА или агара Хоттингера. Материал из всех других отобранных колоний рассевают петлей на отдельных чашках Петри с МПА или агаром Хоттингера для получения изолированных колоний.

На этом этапе исследования для получения чистой культуры сибиреязвенного микроба важно проводить рассев на неселективной среде. Посевы помещают в термостат на 18-20 ч, после чего проводят учет и отбор колоний для дальнейшей идентификации по полной схеме лабораторного исследования.

Из изолированных колоний повторно делают мазки, их фиксируют и окрашивают, как описано выше. При отсутствии достаточного количества культуры исследование проводят на следующие сутки после накопления биомассы.

Биологический метод

В день поступления материала, одновременно с бактериоскопией и посевами на питательные среды с целью выделения возбудителя сибирской язвы, в обязательном порядке проводят биологическую пробу на восприимчивых лабораторных животных.

Для постановки биологической пробы используют белых беспородных мышей (массой 18-2 г), морских свинок (массой 350-400 г) или золотистых хомяков (массой 60-80 г). Исследуемый материал, подготовленный соответствующим образом (раздел "Подготовка проб к исследованию"), суспендируют в небольшом объеме стерильного 0,9%-го раствора хлорида натрия и вводят подкожно во внутреннюю поверхность бедра 2 мышам в объеме 0,2-0,5 мл, 2 морским свинкам или 2 золотистым хомякам в объеме 0,5-1,0 мл. Гибель зараженных животных наступает через 1-3 сут., иногда позже. При вскрытии трупов биопробных животных, павших от сибирской язвы, отмечают характерный для сибиреязвенной инфекции студенистый геморрагический отек подкожной клетчатки на месте введения материала, гиперемию внутренних органов, увеличение селезенки и несвернувшуюся кровь. Из тканей и органов павших животных делают мазки-отпечатки, а также посевы на МПА или агар Хоттингера и селективную среду. Мазки-отпечатки фиксируют в спирте с 3% перекиси водорода в течение 30 мин, а затем окрашивают раствором Ребигера или метиленовой синькой. В мазках при микроскопии сибиреязвенные бациллы расположены короткими цепочками, попарно или поодиночке, окружены розовой капсулой, зачастую сливающейся вокруг групп микробов. В посевах при просмотре чашек вырастают крупные шероховатые колонии с бахромчатой периферией. Идентификацию выросших колоний проводят выше описанными методами.

В случаях, когда чистая культура возбудителя из посевов исходного материала на питательные среды получена раньше, чем наступает гибель зараженных этим материалом животных, суточной бульонной культурой заражают дополнительно двух мышей или морских свинок в дозах, указанных выше.

Наблюдение за животными ведут в течение 10 сут., после чего их исследуют, как описано выше. В целях ускорения исследования количество заражаемых белых мышей увеличивают до 6-10 особей и по одной мыши от каждой пробы забивают через 2-3 сут. после введения исходного инокулюма. В этом случае при вскрытии особое внимание уделяют месту введения. Если в исходном материале имеется достаточное количество сибиреязвенного микроба, то на месте введения можно обнаружить отек подкожной клетчатки. В мазках-отпечатках с места введения выявляются капсульные формы микроба, а в посевах - рост типичных колоний.