Направление материала на исследование

Транспортирование и хранение биологического материала для исследования методом ПЦР должны осуществляться с соблюдением "холодовой цепи": образцы цельной крови - при температуре 2-8 °С - в течение 1 сут; образцы плазмы и сыворотки крови - при температуре 2-8 °С - в течение 5 сут, при температуре -70 °С - длительно.

Образцы остальных видов биологических материалов - при температуре 2-8 °С - в течение 1 сут, при температуре -20 °С - в течение 1 недели, при температуре -70 °С - длительно. Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.

Патологический материал для исследования помещают в стерильную посуду (пробирки, банки или другую лабораторную посуду). Высушенные на воздухе мазки кладут в стерильные чашки Петри, которые обертывают плотной бумагой с надписью "мазок не фиксирован". В направлении к материалу от больного человека или трупа указывают фамилию, имя, отчество больного (умершего), место и время взятия материала, его наименование и предположительный диагноз. Пробы почвы, кормов и других сыпучих объектов помещают в сухую стеклянную банку и закрывают стерильной крышкой, пробкой или пергаментом, можно использовать полиэтиленовые мешочки (кроме проб почвы), которые завязывают шпагатом. Пробы воды наливают в стерильные стеклянные бутылки и закрывают стерильными резиновыми пробками. Допускается использование одноразовых стерильных или многоразовых автоклавируемых пластиковых флаконов. Все пробы нумеруют, емкости заворачивают в лигнин или гигроскопическую вату в количестве, достаточном для сорбции всей жидкости в случае повреждения упаковки. Пробы упаковывают во влагонепроницаемую тару, которую обвязывают, пломбируют или опечатывают, делают надпись "верх, осторожно". Пробы материала и сопроводительные документы доставляются нарочным на спецтранспорте.

В сопроводительной к пробам указывают причину проведения исследования, какой материал и в каком количестве направляют, место и дату отбора материала. Для проб шерсти и кормов дополнительно указывают происхождение, объем партии, вид упаковки и количество упаковочных единиц. К сопроводительной прилагают опись с указанием места отбора каждой пробы.

Подготовка проб к бактериологическому исследованию

Кусочки проб мяса, органов и тканей от трупов помещают в ступку, измельчают ножницами или пестиком, затем заливают стерильным 0,9%-м раствором натрия хлорида в соотношении 1:10, суспензию через марлевый тампон набирают в шприц или пипетку и переносят в пробирку или колбочку.

Воду с илистыми частицами фильтруют через 3 слоя марли. Чистую воду исследуют без предварительной подготовки. С целью концентрирования микробов пробы воды можно профильтровать через мембранные фильтры (N 3) или осадить центрифугированием при 6000 об./мин в течение 15 мин. Осадок с каждого фильтра соскабливают скальпелем (или фильтры измельчают стерильными ножницами), затем заливают 1-2 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида. Осадок после центрифугирования также ресуспендируют в 1-2 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида. Полученную микробную взвесь используют для исследования. Отфильтрованную воду обеззараживают добавлением сухой хлорной извести из расчета 200 г на 1 л.

Тампоны, которыми делают смывы с объектов окружающей среды, отжимают о стенки пробирки и удаляют, а оставшуюся жидкость исследуют.

Пробы почвы освобождают от корней, камешков и тщательно перемешивают. От каждой пробы берут 90-100 г почвы, помещают в колбу, заливают стерильным 0,9%-м раствором натрия хлорида или 0,5% пирофосфата натрия из расчета получения 15-20 мл суспензии. Колбу закрывают, тщательно встряхивают в течение 5-10 мин, дают отстояться 3-5 мин и надосадочную жидкость переносят в пробирку для исследования.

Для повышения эффективности выявления спор В. anthracis целесообразно проводить двукратную обработку образцов почвы диспергирующей жидкостью с 0,5% пирофосфата натрия. Для этого навеску почвы помещают в стерильный стеклянный или пластиковый флакон и заливают диспергирующей жидкостью из расчета получения 15-20 мл суспензии. Суспензию тщательно перемешивают вращательными круговыми движениями в течение 5-10 мин, дают отстояться 3-5 мин, надосадочную жидкость аккуратно переливают в стерильный пластиковый или стеклянный центрифужный стакан. К образцу почвы вновь добавляют диспергирующую жидкость в половинном объеме и повторяют процедуру элюции. Надосадочные жидкости после первой и второй элюций объединяют в одном центрифужном стакане и центрифугированием при 1000 об./мин в течение 15 мин удаляют механические примеси. Надосадок переносят в стерильный центрифужный стакан и микробную взвесь концентрируют центрифугированием при 6000 об./мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость декантируют, а осадок ресуспендируют в 1 мл стерильного 0,9%-го раствора натрия хлорида и используют для дальнейшего исследования. Процедуру центрифугирования проводят в отдельных боксовых помещениях или в боксах биологической безопасности III класса ESCO Airstream Class III, либо их аналогах производства других фирм, оборудованных электрическими розетками и УФ-лампами.

Различные порошкообразные вещества, в том числе пищевые продукты и корма, обрабатывают аналогично почве, используя в дальнейшем надосадочную жидкость или раствор в случае растворения вещества.

Для проб из шкур кусочки массой в 1 г помещают в фарфоровую ступку и заливают стерильным 0,9%-м раствором натрия хлорида из расчета 1:10. Кусочки измельчают ножницами и оставляют при 20 °С на 2-3 ч для размягчения материала. После этого пробы хорошо растирают пестиком в той же жидкости до получения волокнистой мезги, мезгу удаляют, предварительно отжав ее пестиком на внутренней боковой поверхности ступки.

От каждой пробы шерсти отбирают наиболее загрязненные части, измельчают ножницами, вместе с пылью помещают в колбу и заливают стерильным 0,9%-м раствором натрия хлорида. Колбу закрывают, тщательно встряхивают в течение 5-10 мин. Для освобождения от грубых частиц взвесь можно профильтровать через 2-3 слоя марли.

Для избавления от посторонней микрофлоры, подготовленные по описанной выше процедуре пробы из объектов внешней среды, шерсти и кожи, пищевых продуктов делят на две части, одну из которых подвергают термической обработке на водяной бане при 80 °С в течение 20 мин. Пробы от больного человека и животного, из патологического материала и мяса животных, где возбудитель сибирской язвы находится в вегетативной форме, не прогревают.