Особенности газотвёрдофазной хроматографии

В газотвёрдофазной хроматографии неподвижной фазой является твёрдое вещество с большой площадью поверхности. Разделение веществ основано на их различной способности к адсорбции на поверхности твёрдого вещества. В качестве неподвижной фазы в ГАХ используются адсорбенты различной химической природы:

Графитированная сажа является неполярным адсорбентом, сополимеры стирола и дивинилбензола имеют среднюю полярность, силикагели относятся к полярным адсорбентам.

Газотвёрдофазная хроматография используется, главным образом, для анализа смесей газов, низкокипящих углеводородов и т.п. В фармацевтическом анализе она используется значительно реже, чем газожидкостная хроматография.

Особенности газожидкостной хроматографии

В ГЖХ неподвижной фазой является тонкая плёнка жидкости, нанесённая на твёрдый носитель. Твердый носитель должен:

· эффективно удерживать требуемое количество неподвижной жидкой фазы (от 1-2 до 20-30% от массы носителя);

· быть однородным, иметь сферическую форму частиц;

· быть термически и механически прочным;

· не взаимодействовать с разделяемыми веществами, адсорбция веществ на поверхности раздела газ-твёрдый-носитель должна быть минимальной.

В качестве твёрдых носителей в ГЖХ используются, главным образом, диатомитовые носители (хроматон N, хромосорб W, хезасорб N, инертон N и др.), получаемые путём обработки (прокаливание, обработка кислотами, щелочами, силанизирующими реагентами) диатомита - микроаморфной формы диоксида кремния.

Реже в качестве твёрдых носителей применяют синтетические полимеры (например, тефлон), стеклянные шарики и т.д.

Вещества, используемые в качестве неподвижной жидкой фазы, должны

· обладать хорошей разделительной способностью для компонентов анализируемой пробы;

· хорошо растворять определяемые компоненты;

· обладать небольшой вязкостью;

· химически не взаимодействовать с разделяемыми веществами, твёрдым носителем, подвижной фазой;

· быть нелетучими и химически стабильными при рабочей температуре;

· при нанесении на твёрдый носитель прочно связываться с ним, образуя тонкую равномерную плёнку.

В качестве неподвижных жидких фаз в ГЖХ используют:

Сквалан, апиезоны, метилсиликоны являются неполярными жидкими фазами. Среднюю полярность имеют фенилсиликоны, фторалкилсиликоны, сложные эфиры фталевой кислоты, фосфорной кислоты и т.д. К полярным жидким фазам относят карбоваксы, полиэтиленгликольадипинат, полиэтиленгликольсебацинат, полиэтиленгликольсукцинат (ДЭГС), сорбит, инозит и т.д. Неполярные жидкие фазы используют для разделения неполярных веществ, например, углеводородов, галогенпроизводных углеводородов, сложных эфиров и др. Полярные неподвижные фазы, наоборот, применяют, в основном, для разделения полярных веществ: спиртов, фенолов, альдегидов, кетонов и т.д.

Индексы удерживания Ковача

Для идентификации веществ в хроматографии наряду с временем удерживания и удерживаемым объёмом используется параметр, называемый индексом удерживания. В газовой хроматографии для определения индекса удерживания в качестве стандартов берут два соседних н-алкана, один из которых элюируется до исследуемого соединения, а второй после (рис. 23.6).

Рис. 23.6. Определение индекса удерживания Ковача

Логарифмический индекс удерживания равен:

где z - число атомов углерода в молекуле н-алкана, который элюируется первым

Затем по справочным таблицам можно определить круг веществ, которые имеют близкую к рассчитанной величину индекса Ковача

Практическое применение

Газовую хроматографию используют для разделения, идентификации и количественного определения различных соединений, в том числе и лекарственных веществ, которые обладают достаточной летучестью (перегоняются без разложения в интервале температур до 400 °С). Методом ГХ можно определять и малолетучие вещества, если известен способ их переведения в летучие производные.

Газовая хроматография может быть использована для определения веществ, разрушающихся при нагревании, если процесс термического разрушения вещества хорошо воспроизводим.

ГЛАВА 24

Общая характеристика

Жидкостная хроматография- группа хроматографических методов, в которых подвижной фазой является жидкость.

В качестве сорбентов в жидкостной хроматографии применяют:

К неполярным относят также сорбенты с привитыми неполярными группами, например, химически модифицированные кремнезёмы с привитыми алкильными группами, содержащими от 2 до 18 углеродных атомов (рис. 24.1).

В качестве подвижной фазы в жидкостной хроматографии используют воду, водные растворы различных веществ (сильные кислоты, кислотно-основные буферы и т.д.), органические растворители (спирты, ацетонитрил, тетрагидрофуран, диоксан, диэтиловый эфир, алканы и т.д.), а также водно-органические смеси.

Рис. 24.1. Кремнезём с привитыми октадецильными группами

Плоскостная хроматография

В плоскостной хроматографии подвижная фаза перемещается в плоском слое сорбента.

Как в БХ, так и в ТСХ разделение может быть обусловлено раз­личными механизмами, например, адсорбционным, распределитель­ным, ионообменным, ион-парным, адсорбционно-комплексообразова­тельным.

Бумажная хроматография имеет ряд существенных недостатков и поэтому в настоящее время используется сравнительно редко:

· процесс разделения зависит от состава и свойств бумаги;

· содержание воды в порах бумаги может изменяться в зависимости от условий хранения;

· очень низкая скорость хроматографирования (процесс получения хроматограммы может занимать нескольких суток),

· низкая воспроизводимость результатов.

В тонкослойной хроматографии обычно используют хроматографические пластины заводского изготовления с закреплённым слоем сорбента. Основа пластинки может быть изготовлена из алюминиевой фольги, полимера (например, полиэтиленгликольтерефталата), стекла. Для удерживания слоя сорбента на подложке применяется гипс, крахмал, силиказоль и др. Толщина слоя сорбента может быть различной (0,1 мм и более), но обязательно одинаковой в любом месте хроматографической пластинки.

В качестве сорбентов в ТСХ используют силикагель, кизельгур, оксид алюминия, целлюлозу и др. В ионообменных хроматографических пластинках адсорбентами являются различные ионообменники (см. далее). В качестве подвижной фазы применяют либо индивидуальные растворители, либо смеси веществ, взятых в определённом соотношении.

24.2.1. Методика получения плоскостной хроматограммы

Методика получения плоскостных хроматограмм включает в себя следующие этапы:

· предварительный этап - подготовка сорбента и исследуемой пробы, подготовка подвижной фазы, насыщение хроматографической камеры;

· нанесение исследуемой пробы на хроматографическую пластинку или бумагу;

· хроматографирование;

· высушивание хроматограммы;

· обнаружение пятен (зон) разделённых компонентов пробы.

Нанесение исследуемого раствора на хроматографическую пластинку или бумагу проводят градуированным капилляром, микрошприцом или микропипеткой. Капля наносится касанием капилляра или иглы поверхности пластинки (но не надавливанием, так как при этом можно повредить слой сорбента!). Для предотвращения смывания веществ с пластинки нанесение пятен проводят на линии, находящейся на расстоянии 1-2 см от нижнего края пластинки. Оптимальное количество исследуемого вещества (объём раствора), наносимого на пластинку, обычно определяется экспериментально. Если наносимое количество вещества слишком мало, то его можно не заметить при последующем проявлении. Нанесение на пластинку слишком большого количества вещества приводит к перегрузке сорбента и, как следствие, размыванию пятна и уменьшению величины R_f (рис. 24.2).

После нанесения исследуемых веществ на хроматографическую пластинку или бумагу, последние помещают в хроматографическую камеру и проводят хроматографирование. Обычно процесс хроматографирования ведут до тех пор, пока растворитель не поднимется на расстояние ~10 см от линии старта.

В зависимости от направления движения подвижной фазы различают следующие варианты плоскостной хроматографии (табл. 24.1)

Табл. 24.1.

Способы получения плоскостных хроматограмм

Способ	Сущность способа
восходящая хроматография	Фронт подвижной фазы перемещается снизу вверх под действием капиллярных сил. Для получения хроматограммы используется наиболее простое оборудование - в качестве хроматографической камеры можно использовать любую емкость с плоским дном и плотно закрывающейся крышкой, в которую свободно помещается хроматографическая пластинка. Наиболее часто используемый способ получения хроматограмм.
нисходящая хроматография	Фронт подвижной фазы перемещается сверху вниз в основном под действием сил тяжести. Для получения нисходящей хроматограммы в верхней части хроматографической камеры крепится кювета с хроматографической системой, из которой с помощью фитиля на хроматографическую пластинку поступает растворитель.
радиальная хроматография	Исследуемое вещество наносится в центр пластинки. Фронт подвижной фазы перемещается от центра к краю пластинки
двухмерная хроматография	После получения хроматограммы проводится повторное разделение в направлении, перпендикулярном исходному, с использованием подвижной фазы другого состава. Часто используется в бумажной хроматографии, например, в фармакогнозии при изучении состава лекарственных растений.

После завершения процесса хроматографирования пластинку извлекают из хроматографической камеры и сушат. Высушенная пластинка представляет собой хроматограмму исследуемых веществ.

 24.2.2. Анализ плоскостной хроматограммы

Разделяемые компоненты образуют на хроматографической пластинке или полоске хроматографической бумаги отдельные зоны (пятна). Примерный вид плоскостной хроматограммы показан на рис. 24.3. Зоны окрашенных веществ можно обнаружить визуально. Для обнаружения неокрашенных соединений используют физические (например, облучение УФ-светом), химические (обработка хроматограммы различными реагентами-проявителями), а в некоторых случаях и биологические методы.

Некоторые из реагентов, используемых для проявления хроматограмм, показаны в табл. 24.2.

Табл. 24.2.

Некоторые реагенты-проявители, используемые в

плоскостной хроматографии

Положение отдельных хроматографических зон на хроматограмме характеризуют с помощью величины R_f, равной отношению расстояния, пройденного зоной вещества от стартовой линии до центра зоны (x), к расстоянию от стартовой линии до границы фронта растворителя к концу опыта (L)

Величина R_f может принимать значения от 0 до 1. Если R_f = 0, то вещество остаётся на старте, если R_f = 1, то оно поднимается с фронтом растворителя. Величина R_f является качественной хроматографической характеристикой вещества. Она зависит от природы вещества, подвижной и неподвижной фазы, условий хроматографирования и, в определённых пределах, не зависит от концентрации вещества.

Подвижность разделяемых веществ можно также сравнить с подвижностью вещества, принятого за стандарт

Величина R_f связана с коэффициентом распределения вещества (D) и коэффициентом емкости неподвижной фазы по отношению к данному веществу ( ) следующими уравнениями:

Для того чтобы оценить эффективность разделения в плоскостной хроматографии, измеряют расстояние от стартовой линии до нижнего края пятна данного вещества  и расстояние от нижней до верхней границы этого пятна (w) - рис. 24.4. Число теоретических тарелок (N) и высоту эквивалентную теоретической тарелке (H) рассчитывают по формулам:

Коэффициент разделения (a) и разрешение (R_S) в плоскостной хроматографии рассчитывают следующим образом:

Практическое применение

Плоскостная хроматография используется, главным образом, для обнаружения и идентификации веществ.

С целью количественного определения веществ тонкослойную и бумажную хроматографию применяют значительно реже.