Использованные в работе растворы

Раствор 1 (для выделения плазмидной ДНК): 50 мМ глюкоза (0,09 гр); 100 мМTris-HCI (0,1575 гр), pH 8,0; 10 мМ Этилендиаминтетрауксусная кислота (0,292 гр) на 10 мл.

Раствор 2: 0,2 NNaOH(0,16 гр); 1% SDS (0,2 гр) на 20 мл.

Ацетат аммония 5М: 3,85 гр на 5 мл.

Ацетат аммония 2М: 0,154 гр на 0,5 мл.

LB раствор: 1 грТриптон; 0,5 грдрожевой экстракт; 95,2 мл H₂O; 16,7 мкл на 100 мл.

Изопропанол: 10 мл.

ТЕ-буфер ДНК (для растворения ДНК): 1М Tris-HCI; 0,5 М Этилендиаминтетрауксусная кислота.

Ампицилин: 50 мкл на 5 мл H₂O.

Канамицин: 20 мкл на 5 мл H₂O.

Буфер ДНК маркера Sky-High: 10 мМTris-HCI (Ph 8,0); 5 мМ ЭДТА; 12,5% глицерина; 0,008% бромфенолового синего; 0,008% ксиленцианола

Ход работы

Выращивание ночной культуры

Замороженную фракцию клеток EscherichiacolipGS21a и pET28a размораживали на льду. Приготовили по 5 мл растворы Канамицина и Ампицилина. Стерилизовали ламинарный бокс в течении 15 минут. Перед началом работы в боксе вспрыснули 90% раствором спирта.

Нагрели агаризованную питательную среду до жидкого состояния.

За спиртовой горелкой добавили с помощью дозатора и стерильными наконечниками 20 мкл раствора Канамицина в одну чашку Петри, и 50 мклраствора Ампицилина во вторую чашку Петри. Затем влили в чашки агаризованную питательную среду, распределяя равномерно. Подождали 2-3 минуты до полимеризации среды. Посеяли в две чашки культуры клеток EscherichiacolipGS21a и pET28a. Оставили на 12 часов при температуре 37 С^о на Камере рабочей шейкер-инкубаторе Gyromax 737R.  

Перенос вросшихся колоний

Приготовили раствор LB на 100 мл

Приготовились к переносу из твердой агаризованной среды в жидкую среду раствора LB. Стерилизовали ламинарный бокс в течении 15 минут. Перед началом работы в боксе вспрыснули 90% раствором спирта. За спиртовой горелкой прижгли петлю. Взяли с помощью петли одну колонию EscherichiacolipGS21a на ампициллине и добавили в колбу с жидкой средой раствора LB. Взяли с помощью петли одну колонию E.colipET28a на канамицине и добавили в колбу с жидкой средой раствора LB(Рисунок 1). Поставили две колбы на камеру рабочую шейкер-инкубатора Gyromax 737R при 37 градусе с качанием 300 оборотов в минуту на 8 часов.

2.4.3. Выделение плазмидной ДНК

После 8 часовой 300 оборотного качания взяли 2 колбы. Перелили содержимое двух колб в стаканчики лабораторной центрифуги К23Д.

Центрифугировали при 3000 оборотов (g = 1509) в минуту в течении 20 минут при 4С^о.

После слили над осадочную жидкость. Центрифугировали при 3000 оборотов (g = 1509) в минуту в течении 1 минуты и отобрали остатки жидкости.

Ресуспензировали осажденные клетки в 5 мл раствора 1.

Добавили 10 мл раствора и интенсивно перемащивали. Оставили на льду при 0^о на 5 минут.

Добавили 5 мл холодного 5М раствора ацетата аммония, смещивали. После оставили при 0^о на 5 минут.

Центрифугировали при 3000 оборотов (g = 1509) в минуту в течении 20 минут при 4С^о.

Отобрали супернатант микропипеткой, разделили на две центрифужные стаканчики, добавили к каждой по 5 мл изопропанола. После оставили на столе на 10 минут для высаживания ДНК.

Центрифугировали при 3000 оборотов (g = 1509) в минуту при 4С^о в течении 10 минут, отбросили остатки жидкости.

Растворили полученный осадок в каждой микроцентрифужной пробирке в 200 мкл 2М ацетата аммония. Оставили при комнатной температуре на 5 минут.

Центрифугировали при 10000 оборотов (g = 5590) в минуту комнатной температуре 10 минут.

Супернатант перенесли в пробирку с равным объемом изопропанола. Оставили на столе на 10 минут.

Центрифугировали при 10000 оборотов (g = 5590) в минуту комнатной температуре 5 минут.

Сполоснули осадок 70% раствором этанола. Оставили эппендорфки открытыми для выделения этанола.

Определение степени чистоты образцов в спектрофотометре

 После проведения работ по выделению плазмидной ДНК провели анализ чистоты полученных образцов, то есть в двух растворах осуществляли с помощью спектрофотометра GENESYS 10. Кюветы 1.5 см

Приготовили ТЕ-буферный ДНК раствор. Взяли 2 кювета, в одну наполнили TE-буфером, а вторую сначала сполоснули TE-буферным ДНК раствором и после влили исследуемые образцы.

При исследовании получали данные оптической плотности в пределах длины волн от 200 до 300 нм.

По полученным данным построили график и выявили частоту полученных плазмид в исследуемом образце.

Для определения концентрации в выявленных длинах волн перевели нм длины волны в мкг на мл, по которой 1 оптическая единица равна 50 мкг на мл.

2.4.5 Анализ полученных образцов плазмидных ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле

Приготовили раствор буфер ДНК маркера Sky-High

Приготовили 1% гель агарозы на TAE-буфере путем расплавления навески агарозы в микроволновой печи. После остывания до умеренно горячего состояния и залили гель в форму.

Образцы перед нанесением смешивали с 1 мкл буфера для нанесения и электрофорезным буфером так, чтобы наносимый объем составил 10-15мкл, для равномерного распределения ДНК по толщине геля.

Нанесли 1 мкл полученного препарата рядом с 1 мкл маркерной ДНК в лунки приготовленного 1 % геля агарозы.

Провели электрофорез в течении 40 минут при напряжении 100 Ватт.

С помощью системы видео документации MolecularImagerGelDocXr получили фотографию геля в проходящем УФ-свете при длине волны 260 нм.

Идентифицировали полосы плазмидной ДНК в исследуемомобразце. Оценили суммарное количество плазмидной ДНК во внесенной в гель пробе путем сопоставления интенсивности свечения полос полученного препарата с интенсивностью свечения после стандартной ДНК. После этого пересчитали количество полученной ДНК на общий объем препарата.

Вывели выводы о качестве и количестве в исследованных образцах содержания плазмидной ДНК.