Механизм действия ферментов. Роль конформационных изменений фермента при катализе.

1 стадия – диффузия субстрата к ферменту и связывание его с АЦ фермента (образование фермент-субстратного комплекса ES)

E+S=ES

Эта стадия непродолжительна по времени. Зависит от концентрации субстрата в среде и скорости его диффузии к АЦ.

Образование ES происходит практически мгновенно. Изменение энергии активации незначительно.

2 cстадия – преобразование первичного ES в один или несколько ES (ES* и ES**).

ES*àES**

Наиболее медленная стадия. Ее длительность зависит от энергии активации данной реакции.

Происходит разрыв связей субстрата и образование новых в результате взаимодействия каталитических групп субстрата. => Снижается энергия активации.

3 стадия – отделение продуктов реакции от АЦ фермента и диффузия их в окружающую среду (комплекс EP диссоциирует на E и Р).

EPàE+P

Стадия непродолжительная по времени. Определяется скоростью диффузии продуктов реакции в окружающую среду.

При изменении конформации фермента, меняется и его активный центр в сторону повышения комплементарности к субстрату.

1. Какие ферменты цикла трикарбоновых кислот являются регуляторными? Какие соединения и как на них влияют?

Регуляторные ферменты (аллострические) – ферменты, активность которых регулируется путем взаимодействия аллостричского ингибитора с аллострическим центром этого фермента.

Такие ферменты состоят из 2 субъединиц: аллострической и каталитической. Присоединение эффектора к регуляторной субъединице приводит к изменению ее конформации, вследствие чего изменяется конформация и каталитической субъединицы(кооперативный эффект). В том числе и каталитического АЦ в сторону повышения его комплементарности к субстрату.

К регуляторным фермнтам ЦТК относятся:

1. Цитратсинтаза – фермент, катализирующий первую реакции цикла Кребса (образование цитрата из оксалоацетата и ацетил-КоА через промежуточное соединение цитрил-КоА).

Он ингибируется высокими концентрациями АТФ, НАДН, сукцинил-КоА, ацил-КоА, цитрата.

2. Изоцитратдегидрогеназа – фермент, катализирующий 3 реакцию ЦТК (превращение изоцитрата сначала в оксалосукцинат, а затем в 2-оксоглутарат).

Как и всякая ДГ, этот фермент имеет кофермент – акцептор Н, отщепляемый от субстрата.

Истинная изоцитратДГ – НАД-зависимый фермент, который содержится только в матриксе МТХ и катализирует дегидрирование изоцитрата.

Другая НАД-зависимая изоцитратДГ находится в основном в цитоплазме клетки (около 80%). Она катализирует декарбоксилирование оксалосукцината с образованием 2-оксоглутарата.

Реакция, катализируемая данным ф-том, требует присутствия ионов Мn или Мg.

Активируется АДФ, АМФ. Избыток НАДН и АТф ингибирует фермент.

3. 2-оксоглутаратдегидрогеназный комплекс (пируватДГ, дигидролипоилтрансфераза, КоА-SH, дигидролипоилДГ, НАД) – полиферментный комплекс, катализирующий превращение 2-оксоглутарата в сукцинил-КоА (4 реакция ЦТК).

Ингибиторы: НАДН, сукцинил-КоА.

Биосинтез РНК (транскрипция). Первичные транскрипты и созревание (процессинг) рибосомных, транспортных и матричных РНК.

Транскрипция имеет 3 фазы: инициацию, элонгацию и терминацию.

1) Инициация транскрипции происходит вследствие присоединения ДНК-зависимой РНК-полимерзы к промотору, обладающим высоким сродством к этому ферменту. Промотор-это стартовая точка транскрипции.

РНК-полимераза состоит из 5 субъединиц: 4 из них образуют агрегат (кор-фермент), который катализирует обр-е фосфодиэфирных связей м/д нуклеотидами в РНК; 5-я субъединица (сигма-фактор) легко отделяется от субъединицы. Сигма-фактор «выбирает» место транскрипции, а затем к нему присоединяется кор-фермент и начинает транскрипцию.

У эукариотов имеется 3 РНК-полимеразы:

· РНК-полимераза I ответственна за транскрипцию генов рРНК;

· РНК-полимераза II – за тРНК и 5S рРНК;

· РНК-полимераза IIIучаствует в синтзе предшественника мРНК.

РНК-полимеразы наращивают цепь всегда в направлении 5-3, поэтому 5-конец содержит всегда фосфат, а 3-конец – свободный ОН.

Начинается синтез РНК либо с фффА, либо с фффГ, которые специфически спариваются со стартовыми основаниями разных транскриптонов.

2) Элонгация транскрипции происходит при скольжении РНК-полимеразы вдоль матрицы ДНК. Каждый следующий нуклеотид спаривается с комплементарным основанием в ДНК-матрице, а РНК-полимераза «скрепляет» его с растущей цепью РНК фосфодиэфирными связями.

3) Терминация транскрипции происходит после достижения РНК-полимеразой нуклеотидны последовательностей ДНК, являющихся стоп-сигналами. Благодаря терминаторам цепи РНК образуются только опр-й длины.

По мере того, как транскрипция подходит к концу, синтезированная РНК отделятся от ДНК.

Первичные продукты транскрипции являются полными копиями транскриптонов ДНК – РНК-предшественники, в которых есть информативные и неинформативные участки. Такую РНК необходимо освободить от неинформативного груза и оставить только информативную часть молекул РНК.

Образуется 3 типа РНК-предшественников:

1) Предшественник мРНК (пре-мРНК)

2) Предшественник рРНК (пре-рРНК)

3) Предшественник тРНК (пре-тРНК).

В ядре все пре-РНК проходят стадию процессинга (созревания):

1) Вырезание неинформативных участков из пре-РНК

2) Сращивание информативных участков «разорванных» генов – сплайсинг

3) Модификация 5- и 3-концевых участков РНК

Процессинг пре-мРНК

1) Вырезание неинфомативных участков (интронов) пре-мРНК с помощью рибонуклеаз:

они гидролизуют фосфодиэфирные связи,начиная с 5-конца,и оставляют от пре-мРНК необходимую часть готовой мРНК.

2) Экзоны сращиваются в единую цепь с помощью РНК-лигаз.

3) Модификация 5- и 3-концов обр-ся мРНК:

К 5-концу присоединяется олигонуклеотид, который состоит из 2х или 3х метилированных нуклеотидов.

К 3-концу (у эукариот) присоединяется полиадениловый фрагмент – поли(А) с помощью поли(А)-полимеразы.

Процессинг пре-рРНК

Пре-рРНК обр-ся в ядрышке,где находятся транскриптоны рРНК. В ДНК ядрышка гены 18S и 28S рРНК входят в один транскриптон,где расположены попарно друг за другом. В пре-РНК их расположение такое же.

Размеры пре-рРНК достигают 45S. А в ходе процессинга остается чуть больше половины пре-рРНК и освобождаются зрелые 18S и 28S рРНК.

Часть нуклеотидов РНК подвергается модофикации (метилирование основанией метилтрансферазами).

Зрелые рРНК соединяются в ядре с белками рибосом и образуют малую и большую субъединицы рибосом.

Процессинг пре-тРНК.

Пре-тРНК содержит излишки примерно в 40 нуклеотидов. Они удаляются рибонуклеазами.

Затем происходит метилирование оснований тРНК.

Окончастельно зрелая тРНК образуется путем присоединения акцепторного конца (ЦЦА) с помощью спец-й РНК-полимеразы.