Опыт 3. Сравнение проницаемости мембран живых и мертвых клеток

Лабораторная работа № 1.

Физиология растительной клетки

Движение цитоплазмы – характерная особенность живой растительной клетки, показатель активности процессов ее жизнедеятельности. Наиболее удобны для наблюдения за перемещением клеточных органелл крупные клетки с большими вакуолями. Различают движение цитоплазмы спонтанное, постоянное и индуцированное внешними факторами – изменением освещенности, температуры, химическими веществами, механическими воздействиями и т.п. Движение цитоплазмы – один из наиболее чувствительных показателей жизнеспособности клетки. Движение цитоплазмы обеспечивает внутриклеточный и межклеточный транспорт веществ, перемещение органелл внутри клетки. В его осуществлении участвуют элементы цитоскелета – микрофиламенты. Источником энергии этого движения служит АТФ.

Опыт 1. Наблюдение за движением цитоплазмы

Цель опыта: ознакомиться с методами обнаружения движения цитоплазмы.

Материалы и оборудование: микроскоп, настольная лампа, предметные и покровные стекла, пинцет, препаровальная игла, фильтровальная бумага.

Растения: элодея.

Ход работы:

Элодея (Elodea canadensis).  Отрывают лист вблизи верхушки побега и кладут его в каплю воды, взятой из сосуда с элодеей. Объект накрывают покровным стеклом и рассматривают сначала при малом, затем при большом увеличении. Лист элодеи состоит только из двух слоев клеток, и каждый слой легко просматривается под микроскопом. Обрывание листа вызывает в его клетках движение цитоплазмы, которое легко наблюдать по перемещению всех хлоропластов в одном направлении вдоль клеточной стенки. Такое движение называется ротационным. В двух соседних клетках оно может происходить в разных направлениях – по часовой стрелке или против нее. Наиболее интенсивное движение можно увидеть в длинных узких клетках средней жилки листа. У растений, находившихся перед исследованием при слабом освещении или в темноте, движения хлоропластов обычно не наблюдается. Неподвижные хлоропласты располагаются под клеточными стенками параллельно поверхности листовой пластинки. Но если препарат выдержать несколько минут, не снимая со столика микроскопа, при освещении, то движение появляется.

Хлоропласты начинают двигаться сначала медленно, затем быстрее и занимают положение вдоль боковых клеточных стенок, расположенных перпендикулярно поверхности пластинки листа.

Движение цитоплазмы в клетках элодеи можно обнаружить также по перемещению более мелких, чем хлоропласты, органелл – мелких бесцветных «зернышек», взвешенных в цитоплазме. Их перемещение легче всего обнаружить в краевых клетках листовой пластинки, они легче просматриваются. В этих клетках значительно меньше хлоропластов или они отсутствуют.

Задание: сделать схематические рисунки клеток и стрелками указать направление движения цитоплазмы. Отметить наблюдалось ли движение сразу после приготовления препарата или оно менялось под действием освещения.

Опыт 2. Определение скорости движения цитоплазмы

 Цель опыта: ознакомиться с методами измерения скорости движения цитоплазмы.

Материалы и оборудование: микроскоп, настольная лампа, термостат на 35 и 40ºС, предметные и покровные стекла, секундомер, пинцет, препаровальная игла, фильтровальная бумага, этанол.

Растения: элодея, цветки традесканции с опушенными тычиночными нитями.

Ход работы:

На одном из препаратов, используемых в работе, определяют скорость движения цитоплазмы (у элодеи по перемещению хлоропластов). Определение ведется до и после воздействия повышенной температурой, светом, раствором этанола. Выявит влияние света или температуры можно, выдерживая препарат на ярком свету или в термостате при температуре 35 и 40ºС в течение 5, 10 и 15 минут.

Для определения скорости движения цитоплазмы используют секундомер и окулярную линейку, помещенную в окуляр микроскопа. С помощью секундомера отсчитывают время, в течение которого хлоропласт проходит расстояние между двумя выбранными делениями окулярной линейки. Такие измерения в одной и той же клетке проводят несколько раз. По ним рассчитывают среднюю величину и среднюю скорость движения, которая выражается числом делений окулярной линейки, пройденных хлоропластом за 1 с. Если известна цена деления окулярной линейки при данном увеличении микроскопа, то скорость движения можно найти, поделив величину расстояния в микрометрах на число секунд, за которое хлоропласт проходит это расстояние (мкм/с).

Расстояние, которое проходит хлоропласт, можно определить и без окулярной линейки, оценивая его приблизительно в долях диаметра поля зрения микроскопа. Диаметр поля зрения при объективе х40 с окуляром х15 составляет 200 мкм, с окуляром хК15 – 270 мкм, с окуляром хК7 – 900 мкм.

Измерения производят в одних и тех же клетках до и после воздействия на них внешних факторов, которые могут сначала ускорять движение цитоплазмы, затем оно замедляется или даже останавливается. Самым надежным способом стимуляции движения цитоплазмы является освещение клеток. При этом необходимо следить, чтобы освещение не приводило к перегреву клеток. Выдерживание препарата в термостате выше 40ºС, как правило, ведет к прекращению движения цитоплазмы.

Задание: определить скорость движения цитоплазмы в клетках элодеи до и после воздействия на него повышенной температуры, этанола, освещения и заполнить таблицу 1, сделать выводы о влиянии различных факторов на скорость движения цитоплазмы.

Таблица 1

Скорость движения цитоплазмы в клетках элодеи в различных условиях

Наружная цитоплазматическая мембрана клетки (плазмалемма) отделяет клетку от окружающей среды, контролирует транспорт веществ в клетку и из клетки, первая воспринимает информацию о внешней среде. Внутриклеточные мембраны обеспечивают пространственную упорядоченность многочисленных процессов, протекающих в клетке. Они создают изолированные пространства (компартменты), в которых одновременно могут протекать противоположно направленные процессы. В мембраны встроено большое количество мультиферментных комплексов, транспортных систем, рецепторных молекул, обеспечивающих протекание основных жизненных процессов важнейшее свойство клеточных мембран – избирательная проницаемость, благодаря которой через них проходят молекулы только некоторых веществ. Это свойство может изменяться в зависимости от процессов, протекающих в клетке. Избирательная проницаемость мембраны сохраняется до тех пор, пока клетка остается живой. После ее гибели мембраны становятся полностью проницаемыми.

Опыт 3. Сравнение проницаемости мембран живых и мертвых клеток

Цель опыта: пронаблюдать за проницаемостью клеточного сока в живых и поврежденных клетках.

Материалы и оборудование: пробирки – 5 шт., спиртовка, спички, 30%-ный раствор уксусной кислоты, 50%-ный раствор этилового спирта, хлороформ, ФЭК, кюветы.

Растения: корнеплод столовой свеклы.

Все важнейшие проявления жизнедеятельности клетки связаны с мембранами. Одним из наиболее общих, неспецифических и быстрых ответов растительного организма на воздействие различных факторов внешней среды является изменение проницаемости клеточных мембран.

Удобным объектом для наблюдения служат ткани растений, клетки которых содержат в вакуолях красящие вещества, например, бетацианин. Этот пигмент находится в клеточном соке, хорошо растворим в воде и его молекула имеет достаточно большие размеры (М=564). Чтобы попасть во внешнюю среду, молекула бетацианина должна пройти через тонопласт, основной цитоплазматический матрикс и плазмалемму. Диффузия бетацианина из вакуоли в среду может проходить достаточно быстро при действии различных факторов или агентов, вызывающих изменение проницаемости мембран.

Ход работы: нарезать соломкой корнеплод красной свеклы. Для удаления содержимого поврежденных клеток полоски промыть в проточной воде.

В пять пробирок поместить предварительно нарезанные и отмытые в воде полоски корнеплода красной свеклы длиной 1,5–2 см и залить растворами согласно схеме опыта, приведенной в табл. 2. Кусочки должны быть полностью погружены в растворы.

Содержимое второй пробирки вскипятить, третьей – сильно встряхнуть для перемешивания наркотика (хлороформа) с водой. Через 30 мин определить оптическую плотность полученных растворов за сине-зеленым светофильтром (490 нм), полученные значения занести в рабочую тетрадь, в табл. 2, в качестве показателя «Степень окраски раствора».

Задание: выявите различия в проницаемости мембран живых и мертвых клеток. Распределите номера пробирок по нарастанию степени окраски. Проанализируйте полученные результаты, исходя из условий проведения эксперимента, и запишите вывод о проницаемости живой, наркотизированной или мертвой протоплазмы для клеточного сока.

Таблица 2

Схема записи опыта