ТЕМА 5. Санитарно-микробиологическое исследование рыбы и море продуктов

Цель:Овладеть методами бактериологического исследования рыбы и морепродуктов.

 Материальное обеспечение: свежая рыба средних размеров, МПА и МПБ в пробирках, МПА высоким столбиком, стерильные чашки Петри, чашки Петри с агаром Эндо, спиртовки, петли, предметные стекла, набор красок по Граму, фуксин 1:5; инструменты – пинцеты, скальпели, ножницы. Весы лабораторные, разновески, градуированный стакан, мензурка, стерильная вода в колбе и пробирках по 5 мл, пипетки на 1 мл.

Для демонстрации пробирки с положительной и отрицательной реакцией плазмокоагуляцией, чашки Петри с колониями золотистого стафилококка на желточно-солевом агаре. 

Контроль качества свежей, охлажденной, мороженой  рыбы и                                                                                                                                                                 

 морских беспозвоночных 

    Мышцы рыб, в нормальных условиях стерильны. Порча продукта наступает после гибели рыбы. В отличие от мяса теплокровных животных, порчу которых вызывают преимущественно мезофильные гнилостные микроорганизмы, возбудителями гнилостного разложения рыбы являются чаще психрофильные бактерии, активное размножение которых происходит при низкой температуре. Поэтому рыба представляет продукты еще более подверженные порче, чем мясо животных и птиц.

    Микроорганизмы попадают через жабры, кишечник, особенно в период агонии. Микроорганизмы, находящиеся на поверхности тела рыбы, покрытой слизью, являющейся хорошим питательным субстратом для их развития, быстро размножаются и со временем проникают вглубь мягких тканей. Особенно обильно загрязняется рыба при вскрытии брюшка, т.к. при этом неизбежно повреждается кишечник.             

Оценка качества поступившей рыбы:

1. Визуальная и органолептическая оценка качества рыбы;

2. Микроскопическое исследование рыбы проводят для объективной оценки, если доброкачественность рыбного сырья вызывает сомнение;

3. Микробиологическое исследование рыбы проводят при стойкой повышенной обсемененности готовой продукции. Метод микробиологического анализа для определения количества бактерий основан на подсчете колоний, выросших на питательных средах при выращивании посевов в термостате.

1.Свежая рыба имеет красные жабры, светлые выпуклые глаза, специфический рыбный запах. На разрезе мышечная ткань эластичная, плотной консистенции, ямка от надавливания быстро выравнивается и исчезает. Несвежая рыба имеет темно-бурые жабры, мутные запавшие глаза, дряблую консистенцию, неприятный гнилостный запах, внутренние органы распавшиеся, кишечник лизированный.

2. Перед микроскопическим исследованием рыбы кожу посередине спины или ближе к голове освобождают от чешуи и прижигают раскаленным скальпелем. Затем стерильным скальпелем вырезают кусочки мяса рыбы площадью около 1,5 см² и толщиной 1,5-2,0 см. Кусочком мяса делают препарат-отпечаток на предметном стекле. Отпечаток мышечной ткани фиксируют над пламенем горелки, окрашивают простым методом и просматривают не менее 10 полей зрения под иммерсией. В препаратах-отпечатках, приготовленных из свежей рыбы, не заметны остатки разложившейся мышечной ткани, в одном поле зрения могут встречаться единичные кокки и палочки. У рыбы подозрительной свежести в мазках из поверхностных слоев мышц находят 30-60, а в мазках из глубинных слоев 20-30 диплококков. На стекле заметны следы распавшейся ткани мышц. 

3.При стойкой повышенной обсемененности готовой продукции для выявления источников обсеменения проводят микробиологическое исследование сырья. Контроль включает определение в сырье количества МАФАнМ, дополнительно определяют наличие БГКП, золотистых стафилококков, сальмонелл и парагемолитических вибрионов. Микробиологические анализы морских беспозвоночных (устриц, мидий и др.), подготовленных к реализации в живом виде, проводятся систематически, при этом контролируется каждая партия.             

В таблице 10 приведены микробиологические нормативы количества МАФАнМ, БГКП, золотистого стафилококка и сальмонелл.

                                                                                    Таблица 10

                  Микробиологические нормативы свежей рыбы

                          и морских беспозвоночных

* Парагемолитические вибрионы, листерии должны отсутствовать в 25 г морских беспозвоночных, подготовленных к реализации в живом виде.

            Определение количества МАФАнМ                             

Отбор проб. Исследуемую рыбу и крупные экземпляры нерыбных объектов морского промысла отбирают в количестве не более 3 штук. От каждого экземпляра из нескольких мест вырезают кусочки с кожей и мышцами, не затрагивая кишечник (за исключением отбора проб на определение наличия парагемолитических вибрионов), площадью около 4 см², толщиной 4-5 мм, эти кусочки рыбы помещают во взвешенный стакан. Вновь взвешивают и по разности весов устанавливают массу отобранной пробы. Пробу измельчают и заливают стерильной жидкостью в таком количестве, чтобы получить конечное разведение 1:10.

  Подготовленную пробу тщательно перемешивают, взвесь отстаивают в течение 5 мин. Надосадочную жидкость используют для приготовления последующих разведений. 1 мл из исходного разведения (10^-1) переносят в пробирку с 9 мл стерильного раствора для разведения, не прикасаясь к поверхности жидкости в этой пробирке, перемешивают новой стерильной пипеткой, и содержимое в количестве 1 мл переносят в следующую пробирку. В результате исследуемый продукт оказывается разведенным в 10, 100 и более раз. Степень разведения навески для высева на плотные питательные среды выбирают так, чтобы общее количество колоний, выросших на чашке, колебалось в пределах от 30 до 300. Посев проводят по следующей методике: из двух последних разведений в чашки Петри вносят по 1 мл разведенного материала или смыва, заливают 15 мл расплавленного и охлажденного до 50⁰С агара, перемешивают (из каждого разведения делают посев в две-три чашки). После застывания МПА, чашки переворачивают вверх дном и помещают в термостат при 30⁰С на 72 часа. В некоторых случаях допускается предварительный учет колоний через 48 ч с последующим подсчетом через 72 ч. Количество микроорганизмов в 1 г (1мл) продукта определяют по формуле:

                К = А В С, где 

К – количество микроорганизмов в 1 г, КОЕ;

А – среднее арифметическое число колоний в чашке;

В – степень разведения

С – масса, объем, поверхность (г, мл)

Для вычисления среднего арифметического нельзя использовать посевы, где количество выросших колоний на чашках менее 30.

- При отсутствии роста колоний результаты фиксируют, таким образом, *Количество микроорганизмов менее 1*

- Если при посевах оказалось, что во всех разведениях на засеянных чашках менее 30 колоний, в результате анализа рекомендуется написать: *Рост единичных колоний при посеве (указать количество засеянного продукта)*.

- Если на чашках, более чем на 1\2 их площади, имеется расползающийся рост спорообразующих микроорганизмов, подсчет изолированных колоний невозможен, в результате анализа следует написать: *Рост спорообразующих микроорганизмов*. Результаты выражают в колониеобразующих единицах – КОЕ (мл, г).                      

              Определение бактерий группы кишечных палочек                                                                                                     

Метод основан на способности бактерий группы кишечных палочек сбраживать в среде Кесслера лактозу с образованием кислоты и газа. Бактерии группы кишечных палочек (БГКП) – это аэробные и факультативно-анаэробные, грамотрицательные, не образующие спор палочки, ферментирующие лактозу с образованием кислоты и газа при температуре 37⁰С в течение 24 часов (бродильная проба), не обладающие окислительной способностью.

Для индикации БГКП в исследуемом материале, 10 г продукта и 10 мл исходного разведения продукта засевают во флаконы со 100 мл и 50 мл питательной среды соответственно. По 1 мл и 0,1 мл и т.д. исходного разведения продукта вносят в пробирки с 5 мл питательной среды. По действующим нормативам засевается то количество продукта, в котором нормируется отсутствие бактерий группы кишечных палочек. Допускается засевать 1 г продукта в 10 мл питательной среды.

Для индикации БГКП в смывной жидкости с оборудования и рук, тампоны или марлевые салфетки опускают в пробирки с 5 мл среды Кесслера. Посевы помещают в термостат при температуре 37⁰С на 24 часа, затем из пробирок и колб с пузырьками газа в поплавках делают посев на плотную дифференциальную среду Эндо. Через сутки после инкубирования в термостате проводят учет. При наличии на среде Эндо колоний (красных с металлическим блеском и без него, розовых), характерных для группы кишечных палочек, проводят их изучение. Из изолированных колоний готовят препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии грамотрицательных, без спор палочек, делают заключение о присутствии БГКП. Для уточнения при обнаружении грамотрицательных, не образующих спор палочек надо провести оксидазный тест: часть колонии со среды Эндо наносят штрихом на фильтровальную бумагу, предварительно смоченную реактивом для определения цитохромоксидазы. Оксидазный тест у кишечной палочки отрицательный и индикаторная бумага не должна изменять цвет, а (если бумага синеет – оксидазный тест положительный).

       Индикация наличия золотистых стафилококков

      Метод основан на выявлении характерного роста бактерий на элективных средах, изучении морфологических свойств, наличие фермента плазмокоагулазы.

1 г продукта и 1 мл разведения (10^-1) засевают в пробирку с 6-7 мл солевого рыбопептонного бульона (7% NaCl). При исследовании соленых продуктов (свыше 5%) дополнительно проводят посев в 1%-ный глюкозный РПБ. Посевы помещают в термостат при температуре 37⁰ на 24 ч. Из сред обогащения (солевого, глюкозного бульонов) проводят посев на элективные среды: желточно- или молочно-солевой агар или среду Байрд-Паркер. Посевы выдерживают при 37⁰С в течение 24 ч.

Из типичных для стафилококков колонии (на молочно- и желточно-солевом агаре с радужным венчиком вокруг колоний; на среде Байрд-Паркер - черные, блестящие с узким белым краем, окруженные прозрачной зоной) готовят препараты, окрашивают по Граму, микроскопируют, отсевают на скошенный агар в пробирках для получения чистой культуры и инкубируют при температуре 37⁰С в течение 24 ч. С суточной культурой ставят реакцию плазмокоагуляции.

Реакция плазмокоагуляции. В пробирку с 0,5 мл кроличьей плазмы, разведенной физраствором в соотношении 1:5 (1 мл плазмы + 4 мл физраствора), вносят петлю суточной культуры стафилококка. Для контроля одну пробирку с плазмой оставляют незасеянной. Пробирки помещают в термостат при температуре 37⁰С. Учет реакции плазмокоагуляции проводят через 2, 4 ч. Реакция считается положительной, если сгусток образовался в течение 24 ч.

    Определение наличия бактерий рода сальмонелл

Метод основан на способности бактерий рода Сальмонелл, расти на дифференциально-диагностических средах, и давать реакцию агглютинации со специфическими сальмонеллезными сыворотками.

Навеску продукта в количестве 25 г засевают в 100 мл среды обогащения (магниевую или селенитовый бульон). Посевы помещают на 18-20 ч в термостат при температуре 37⁰С.

На второй день исследования из сред обогащения делают высев в чашки Петри на плотные дифференциально-диагностические среды: Висмут-сульфитный агар (ВСА), среду Плоскирева, Левина или Эндо. Перед посевом среду необходимо подсушить в термостате, чтобы рост не сливался и выросли изолированные колонии. Посевы на средах Эндо и Плоскирева термостатируют в течение 15-18 ч, на среде ВСА - 48 ч при 37⁰С.

На ВСА сальмонеллы образуют черные с металлическим блеском колонии, цвет питательной среды под колониями черный. Исключение составляют S.paratyphi, S.cholerae suis и ряд других, растущих в виде мелких серовато-зеленых колоний с черным центром и без него. Кишечная палочка на ВСА образует бесцветные, зеленоватые или серые колонии или не дает роста.

На среде Эндо колонии сальмонелл бесцветные, слабо-розовые, выпуклые. На средах Плоскирева и Левина колонии прозрачные, голубоватые, бледные или нежно-розовые.

С дифференциально-диагностических сред отсевают несколько колоний на трехсахарный агар с мочевиной или среду Клиглера с мочевиной: посевы делают сначала штрихом по скошенной поверхности, а затем уколом в столбик. Посевы выдерживают в термостате при температуре 37⁰С 24 ч. На этих средах учитывают способность культуры ферментировать глюкозу, лактозу и мочевину. Для сальмонелл характерно разложение глюкозы с образованием газа, лактозу и мочевину они не разлагают. Готовая среда – трехсахарный агар с мочевиной имеет розовый цвет. Отсутствие изменения цвета скошенной поверхности указывает на то, что лактоза и сахароза не разлагаются исследуемой культурой. Желтое окрашивание столбика, образование газа (разрывы в глубине агара) и сероводорода (почернение) указывает на рост бактерий из рода сальмонелл.

   Желательно со среды Клиглера или с трехсахарного агара, отсеять выросшую культуру на скошенный агар, короткий пестрый ряд, включающий среды Гисса с лактозой, глюкозой, маннитом, сахарозой, мальтозой. Для определения индола и сероводорода посев делают на рыбо- или мясо-пептонный бульон, после чего над посевом между пробкой и стенкой пробирки закрепляют узкую полоску фильтровальной бумаги, смоченную уксусно-кислым свинцом для определения сероводорода и раствором щавелевой кислоты для определения индола. Посевы термостатируют при температуре 37⁰С в течение 24 ч.

Таким образом, к сальмонеллам относятся бактерии, не разлагающие лактозу, сахарозу и мочевину, ферментирующие глюкозу, маннит и мальтозу с образованием газа, продуцирующие сероводород и не образующие индол.

Для окончательного заключения с выделенной культурой ставят РА на предметном стекле с поливалентной, О- и Н-агглютинирующими монорецепторными сальмонеллезными сыворотками. В случае положительной реакции агглютинации с монорецепторными О- и Н-агглютинирующими сыворотками делают окончательный вывод о присутствии в исследуемом продукте сальмонелл.

       Определение парагемолитических вибрионов

Метод основан на выявлении типичных колоний на дифференциально-диагностическом агаре (ДДА) определенного состава и установления принадлежности бактерий к парагемолитическим вибрионам по морфологическим и биохимическим свойствам. Для исследования на сальмонеллы, листерии и парагемолитические вибрионы пробы сырья отбирают с частью кишечника и жабер. Из усредненной пробы отбирают навеску в 25 г. Парагемолитические вибрионы, листерии должны отсутствовать в 25 г морских беспозвоночных, подготовленных к реализации в живом виде. 

    Для выявления присутствия парагемолитических вибрионов пробу в количестве 25 г переносят в 100 мл жидкой среды обогащения. Посевы помещают в термостат при 37⁰С, через 24 ч проводят пересев на поверхность плотного ДДА. Чашки инкубируют при 37⁰С в течение 24 ч, выявляют типичные колонии парагемолитических вибрионов.

 При подтверждении принадлежности выделенных на ДДА микроорганизмов к парагемолитическим вибрионам проводят изучение морфологических и биохимических свойств.

     Парагемолитические вибрионы – мезофильные грамотрицательные палочки, прямые или слегка изогнутые, не образующие спор, активно подвижные, содержат цитохромоксидазу, не расщепляют лактозу и сахарозу, растут на питательных средах с содержанием хлорида натрия от 3 до 8%, декарбоксилируют лизин, образуют индол, ферментируют (без газообразования) арабинозу, глюкозу, мальтозу, не образуют ацетилметилкарбинол.

 Для идентификации бактерий делают пересев с ДДА в 1%-ную пептонную воду с 3% хлорида натрия, на которой появляется помутнение с образованием нежной голубой пленки .

     Готовят мазки, окрашивают по Граму, изучают морфологию клеток.

    Подвижность изучают под фазово-контрастным микроскопом в раздавленной капле или при посеве в полужидкий МПА (0,25% агара), содержащий 3% хлорида натрия. Засевают суточную бульонную культуру в полужидкий МПА и инкубируют при температуре 37⁰С в течение 24 ч. Подвижные формы образуют диффузное помутнение, слабоподвижные - вырастают по ходу укола.                                 

                            Задания для самостоятельной работы

1.Провести органолептическую оценку исследуемой рыбы.

2.Провести посев исследуемой рыбы с целью определения МАФАнМ.

3. Провести посев исследуемой рыбы с целью индикации БГКП и сальмонелл.

4.Определение наличия парагемолитических вибрионов в исследуемой рыбе.